奶业创新团队

Milk Research Team

2022 年度报告

Annual Report

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

Institute of Animal Sciences, CAAS

用阳光，迎接 2023

2022 年，奶业创新团队潜心科研，努力拼搏，圆满完成各项任务，

取得可喜成绩。

团队围绕奶牛健康养殖与牛奶品质形成机理、奶产品风险评估与

营养功能评价两个研究领域，发表论文 47 篇，其中 SCI 文章 33 篇，

中文文章 14 篇，出版著作 12 部，获得授权发明专利 3 项。成功申报

“十四五”国家重点研发计划项目 2 项。

受农业农村部委托，团队组织全国优势单位，牵头实施生鲜乳质

量安全监测计划、液态奶中复原乳监测计划和奶产品质量安全风险专

项等项目，发布《中国奶产品质量安全研究报告（2021 年）》和《中

国奶业质量报告（2022）》。成功召开第七届“奶牛营养与牛奶质量”

国际研讨会。

牵头国家奶业科技创新联盟，在全国 25 个省 64 家企业实施优质

乳工程，被列入国家卫健委《国民营养计划》重点工作。

新春的脚步正在向我们走来。在此，向关心、支持和帮助奶业创

新团队的领导、专家和朋友，致以最衷心的感谢和最崇高的敬意！

祝您们节日愉快、阖家欢乐！

执行首席专家：

首席专家：

团队简介

奶产品质量与风险评估科技创新团队（简称奶业创新团队，MRT）

是首批入选创新工程的团队，建有农业农村部奶及奶制品质量安全控

制重点实验室、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）、

农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）和国家奶业国际

联合研究中心等平台。

团队始终聚焦奶牛健康养殖与牛奶品质形成机理、奶产品质量

安全风险评估与营养功能评价两个研究领域，发挥科技引领作用。近

五年发表 SCI 文章 100 余篇，获得国家科技进步二等奖 1 项，被评为

“全国农业科研杰出创新团队”和“中国农业科学院青年文明号”。

农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）

国家农业检测基准实验室（奶及奶制品污染物）

奶牛健康养殖与牛奶品质形成机理

奶产品质量安全风险评估与营养功能评价

全国生鲜乳质量安全监测

奶业

创新团队

服务行业 全国奶产品质量安全风险评估

农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）

科研领域

技术平台 农业农村部奶及奶制品质量安全控制重点实验室

国家奶业科技创新联盟

国家奶业国际联合研究中心

目 录

一、成果概览 ..................................... 1

（一）文 章 ........................................... 2

（二）著 作 .......................................... 12

（三）发明专利 ........................................ 13

（四）标 准 .......................................... 14

二、研究进展 .................................... 15

领域一：奶牛健康养殖与牛奶品质形成机理 .................. 16

1. 宏基因组指导未培养微生物分离培养的机遇与挑战 ....... 16

2. 荷斯坦奶牛生乳总固形物含量的变化与瘤胃细菌群落有关 ... 39

3. 基于活性和富集的宏蛋白质组学解析牛瘤胃微生物活性脲酶 49

4. 瘤胃细菌对奶牛个体氮利用效率的贡献 ................. 58

5. 提高生乳中ω-3 多不饱和脂肪酸对生乳风味影响较小 ..... 66

6. 牛奶中ω-6 和ω-3 脂肪酸比例影响挥发性物质的组成 .... 74

7. 新的α-亚麻酸瘤胃生物氢化中间产物：t9c12c15-C18:3 .. 81

8. 自然霉变日粮霉菌毒素暴露对泌乳奶牛生产性能与健康影响 87

9. 不同纤维降解酶的作用顺序促进玉米秸秆降解 ........... 93

10. 亚麻籽物理形态影响生乳中ω-3 多不饱和脂肪酸的富集 . 102

领域二：奶产品质量安全风险评估与营养功能评价 ........... 113

1. AFM1 与 OTA 单独及联合处理诱导新生肠道炎症损伤 ...... 113

2. 揭示黄曲霉毒素 B1 和黄曲霉毒素 M1 对肠道 NCM460 细胞的加

和毒性作用 ........................................... 124

3. 乳铁蛋白缓解黄曲霉毒素 M1 诱导的 NCM460 细胞凋亡 ....... 135

4. 乳铁蛋白对黄曲霉毒素 M1 诱导的肠道损伤具有保护作用 .... 142

5. 乙酸、丙酸和丁酸对离体培养的胎鼠空肠和未成熟小肠细胞的

抗炎作用 ............................................. 153

6. 全转录组分析揭示黄曲霉毒素 M1 和赭曲霉毒素 A 发挥肠道免

疫抑制的 ceRNA 调控网络 ............................... 163

7. 代谢组学分析揭示黄曲霉毒素 M1 和赭曲霉毒素 A 联合处理致

小鼠肝脏损伤机制 ..................................... 175

8. 2'-岩藻糖基乳糖通过调节肠道菌群和促进 MUC2 表达改善炎症

性肠病 ............................................... 182

9. 不同铁饱和度重组乳铁蛋白对幼鼠肠炎损伤的保护作用 ..... 189

10. 工业污染区重金属对牛奶品质的影响 ................. 196

11. 牧场环境和生鲜乳中蜡样芽孢杆菌的腐败研究 ......... 201

12. 头孢菌素类抗生素对奶牛粪便中菌群和耐药基因的影响 . 206

13. 从中国不同地区的生乳中分离出的金黄色葡萄球菌的耐药性

和分子特征 ........................................... 212

14. 牧场垫料材料对生乳微生物结构与耐药基因的影响 ..... 220

15. 基于 16S rDNA 基因测序的 Source Tracker 模型评估巴氏杀

菌乳中微生物风险关键点分析 ........................... 229

16. 我国不同地区生乳中嗜冷菌的多样性分析 ............. 233

17. 生乳中假单胞杆菌的种类及其蛋白酶活力的分析 ....... 242

三、服务行业 ................................... 248

1. 奶业创新团队与蒙牛乳业集团召开乳品质量提升会议 .... 249

2. 2021 年生鲜乳质量安全监管项目绩效评价工作会议 ...... 251

3. “兽药残留分析样品前处理技术”培训 ................ 253

4. 研讨奶业国家标准 助力高质量发展 ................... 254

5. 2022 年全国生鲜乳质量安全监测项目检测技术培训班召开 .. 256

6. 飞鹤远来共商新鲜定义 乳业相携畅谈产业标准 ......... 258

—2022 年度飞鹤乳业与奶业创新团队合作进展交流会议召开 .. 258

7. 奶业创新团队 4 项农业行业标准顺利通过审定 .......... 261

8. 我国首个奶牛养殖场生乳中病原微生物风险评估标准顺利通过

审定 ................................................. 263

9. 严格过程控制 保障牛奶质量安全 ..................... 265

10. 瞄准国际前沿 建立我国首个生乳中体细胞过程控制 .... 267

技术规范 ............................................. 267

11. 我国首个牛奶中未变性乳铁蛋白测定方法农业行业标准通过

审定 ................................................. 269

12. 科技挖掘品质特色 助力打造优质奶源 ................ 272

13. 乳品专项检测技术培训班顺利召开 ................... 274

14. 奶业创新团队 5 项团体标准顺利通过审定 ............. 276

15. 科学定义新鲜品质，让中国宝宝喝上优质奶粉 ......... 278

四、党建与文化建设 ............................. 280

1. 奶产品质量与风险评估团队党支部召开专题组织生活会 .. 281

2. 奶产品质量与风险评估团队党支部开展 ................ 283

“以史为鉴，自强不息”主题党日活动 ................... 283

3. 居家办公不掉线 共克时艰勇向前 ..................... 285

4. 2022 年研究生毕业答辩会议 .......................... 287

5. 2022 年研究生中期和开题报告会议 ..................... 289

6. 贺信精神再次点燃青春激情 奶业团队坚定信心勇争一流 . 291

7. 赓续伟大建党精神 打造畜产品学科第一方阵 ........... 293

—奶产品质量与风险评估团队党支部和优质功能畜产品团队党支

部联合主题党日活动 ................................... 293

8. 奶业创新团队召开 2022 年上半年总结会 ............... 295

9. 奶产品质量与风险评估团队党建与科技创新融合发展 .... 297

10. 学习贯彻二十大精神，培养一流人才，建设一流团队 ... 299

五、专题报告 ................................... 302

大力发展尿素饲料是实现牛羊豆粕减量替代的战略途径 ..... 303

第七届“奶牛营养与牛奶质量”国际研讨会成功召开 ....... 308

申报获批两项国家重点研发计划项目 ..................... 328

六、大事记 ..................................... 332

一、成果概览 █

﹣1﹣

一、成果概览

█ MRT 2022 年度报告

﹣2﹣

2022 年，发表论文 47 篇，其中 SCI 文章 33 篇，中文文章 14

篇，出版著作 12 部，获得授权发明专利 3 项，发布团队标准 5 项。

（一） 文 章

领域一：奶牛健康养殖与牛奶品质形成机理

1. Liu Sijia, Moon Christina D, Zheng Nan, Huws Sharon, Zhao

Shengguo, Wang Jiaqi. Opportunities and challenges of using

metagenomic data to bring uncultured microbes into cultivation.

Microbiome. 2022. 10(1): 76.

2. He Yue, Zhang Xiaoyin, Li Min, Zheng Nan, Zhao Shengguo, Wang

Jiaqi. Coptisine: A natural plant inhibitor of ruminal bacterial urease

screened by molecular docking.

Science of the Total Environment. 2022. 808: 151946.

3. Huang Guoxin, Li Ning, Liu Kaizhen, Yang Jiyong, Zhao Shengguo,

Zheng Nan, Zhou Jinhui, Zhang Yangdong, Wang Jiaqi. Effect of

flaxseed supplementation in diet of dairy cow on the volatile organic

compounds of raw milk by HS-GC-IMS.

Frontiers in Nutrition. 2022. 9: 831178.

一、成果概览 █

﹣3﹣

4. Zhang Xiaoyin, Xiong Zhanbo, Li Min, Zheng Nan, Zhao Shengguo,

Wang Jiaqi. Activity- and enrichment-based metaproteomics insights

into active urease from the rumen microbiota of cattle.

International Journal of Molecular Science. 2022. 23: 817.

5. Liu Kaizhen, Zhang Yangdong, Huang Guoxin, Zheng Nan, Zhao

Shengguo, Wang Jiaqi. Ruminal bacterial community is associated

with the variations of total milk solid content in Holstein lactating cows.

Animinal Nutrition. 2022. 9: 175-83.

6. Li Min, Zhong Huiyue, Li Ming, Zheng Nan, Wang Jiaqi, Zhao

Shengguo. Contribution of ruminal bacteriome to the individual

variation of nitrogen utilization efficiency of dairy cows.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 815225.

7. Jia Yangyang, Zhao Shengguo, Guo Wenjie, Peng Ling, Zhao Fang,

Wang Lushan, Fan Guangyi, Zhu Yuanfang, Xu Dayou, Liu Guilin,

Wang Ruoqing, Fang Xiaodong, Zhang He, Kristiansen Karsten,

Zhang Wenwei，Chen Jianwei. Sequencing introduced false positive

rare taxa lead to biased microbial community diversity, assembly, and

interaction interpretation in amplicon studies.

Environmental Microbiome. 2022. 17(1):43.

█ MRT 2022 年度报告

﹣4﹣

8. Zhao Shengguo, Diaby M, Zheng Nan, Wang Jiaqi. Sequential action

of different fiber-degrading enzymes enhances the degradation of corn

stover.

Agriculture. 2022. 12(2): 181.

9. Wu Xufang, Guo Liya, Huang Guoxin, Tang Wenhao, Zhao Shengguo,

Wang Jiaqi, Zhang Yangdong. Effects of dietary natural mycotoxins

exposure on performance, biochemical parameters and milk small

molecule metabolic pathways of lactating cows.

Agriculture. 2022. 12(3): 420.

10. Li Ning, Huang Guoxin, Zhang Yangdong, Zheng Nan, Zhao

Shengguo, Wang Jiaqi. Diversity of volatile compounds in raw milk

with different n-6 to n-3 fatty acid ratio.

Animals (Basel). 2022. 12(3): 252.

11. Huang Guoxin, Wang Jiaqi, Liu Kaizhen, Zheng Nan, Zhao Shengguo,

Qu Xueyin, Yu Jing, Zhang Yangdong, Wang Jiaqi. Effect of flaxseed

supplementation on milk and plasma fatty acid composition and plasma

parameters of holstein dairy cows.

Animals (Basel). 2022. 12(15): 1898.

一、成果概览 █

﹣5﹣

12. Huang Guoxin, Guo Liya, Chen Meiqing, Wu Xufang, Tang Wenhao,

Zheng Nan, Zhao Shengguo, Zhang Yangdong, Wang Jiaqi.

Biohydrogenation pathway of alpha-linolenic acid in rumen of dairy

cow in vitro.

Animals (Basel). 2022. 12(4): 502.

13. 唐文浩, 张养东, 郑楠, 王加启. 苜蓿青贮品质评价研究进展[J].

动物营养学报. 2022. 34(07):4165-4173.

14. 杨继勇, 张养东, 郑楠, 王加启. 牛奶感官特征及风味物质的研究

进展[J].

动物营养学报. 2022. 34(05):2790-2797.

15. 武旭芳, 张养东, 郑楠, 王加启. 乳中短链脂肪酸组成、生理功能

及检测技术研究进展[J].

动物营养学报. 2022. 34(04):2148-2155.

16. 陈美庆, 张养东, 郑楠, 王加启. 短链脂肪酸调控奶牛乳腺乳脂合

成作用机制的研究进展[J].

动物营养学报. 2022. 34(03):1426-1433.

17. 卜莹, 郑楠, 王加启, 赵圣国. 免疫球蛋白调控动物胃肠道健康及

微生物功能的研究进展[J].

█ MRT 2022 年度报告

﹣6﹣

中国畜牧兽医. 2022. 49(10):3800-3808.

18. 唐文浩, 张养东, 黄国欣, 杨继勇, 刘凯珍, 郑楠, 王加启. 体外

产气法评价不同物理状态苜蓿干草营养价值的研究[J].

饲料工业. 2022. 43(20):27-32.

19. 杨继勇, 张养东, 郑楠, 王加启. 锶元素的生物学功能及其在人体

内的代谢研究进展[J].

中国食物与营养. 2022. 28(09):50-56.

领域二：奶产品质量安全风险评估与营养功能评价

20. Du Bingyao, Meng Lu, Liu Huimin, Zheng Nan, Zhang Yangdong,

Zhao Shengguo, Li Ming, Wang Jiaqi. Diversity and proteolytic

activity of Pseudomonas species isolated from raw cow milk samples

across China.

Science of The Total Environment. 2022. 838(Pt 3): 156382.

21. Gao Yanan, Wang Ziwei, Yang Xue, Wang Jiaqi, Zheng Nan.

Aflatoxin M1 and ochratoxin A induce a competitive endogenous RNA

regulatory network of intestinal immunosuppression by wholetranscriptome analysis.

Science of The Total Environment. 2022: 158777.

一、成果概览 █

﹣7﹣

22. Yao Qianqian, Gao Yanan, Fan Linlin, Wang Jiaqi, Zheng Nan. 2'-

Fucosyllactose remits colitis-induced liver oxygen stress through the

gut–liver–metabolites axis.

Nutrients. 2022. 14(19): 4186.

23. Yao Qianqian, Fan Linlin, Zheng Nan, Blecker christophe, Delcenserie

véronique, Li Huiying, Wang Jiaqi. 2'-Fucosyllactose ameliorates

inflammatory bowel disease by modulating gut microbiota and

promoting MUC2 expression.

Frontiers in Nutrition. 2022. 9: 822020.

24. Du Bingyao, Meng Lu, Wu Haoming, Yang Hongjian, Liu Huimin,

Zheng Nan, Zhang Yangdong, Zhao Shengguo, Wang Jiaqi. Source

tracker modeling based on 16S rDNA sequencing and analysis of

microbial contamination sources for pasteurized milk.

Frontiers in Nutrition. 2022. 9: 845150.

25. Wu Haoming, Wang Yang, Du Bingyao, Li Huiying, Dong Lei, Hu

Haiyan, Meng Lu, Zheng Nan, Wang Jiaqi. Influence of dairy cows

bedding material on the microbial structure and antibiotic resistance

genes of milk.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 830333.

█ MRT 2022 年度报告

﹣8﹣

26. Meng Lu, Zhang Ruirui, Dong Lei, Hu Haiyan, Liu Huimin, Zheng

Nan, Wang Jiaqi, Cheng Jianbo. Characterization and spoilage

potential of Bacillus cereus isolated from farm environment and raw

milk.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 940611.

27. Liu Huimin, Dong Lei, Zhao Yankun, Meng Lu, Wang Jiaqi, Wang

Cheng, Zheng Nan. Antimicrobial susceptibility, and molecular

characterization of staphylococcus aureus isolated from different raw

milk samples in China.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 840670.

28. Du Bingyao, Meng Lu, Liu Huimin, Zheng Nan, Zhang Yangdong,

Zhao Shengguo, Wang Jiaqi. Single molecule real-time sequencing and

traditional cultivation techniques reveal complex community structures

and regional variations of psychrotrophic bacteria in raw milk.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 853263.

29. Wang Fengen, Chen Meiqing, Luo Runbo, Huang Guoxin, Wu Xufang,

Zheng Nan, Zhang Yangdong, Wang Jiaqi. Fatty acid profiles of milk

from holstein cows, jersey cows, buffalos, yaks, humans, goats, camels,

and donkeys based on gas chromatography-mass spectrometry.

一、成果概览 █

﹣9﹣

Journal of Dairy Science. 2022. 105(2): 1687-700.

30. Fan Linlin, Yao Qianqian, Wu Haoming, Wen Fang, Wang Jiaqi, Li

Huiying, Zheng Nan. Protective effects of recombinant lactoferrin with

different iron saturations on enteritis injury in young mice.

Journal of Dairy Science. 2022. 105(6): 4791-803.

31. Wu Haoming, Wang Yang, Li Huiying, Meng Lu, Zheng Nan, Wang

Jiaqi. Protective effect of alkaline phosphatase supplementation on

infant health.

Foods. 2022. 11(9): 23.

32. Wu Hongya, Fan Linlin, Gao Yanan, Wang Jiaqi, Zheng Nan. The

protective effects of iron free lactoferrin on lipopolysaccharideinduced intestinal inflammatory injury via modulating the nf-b/ppar

signaling pathway.

Foods. 2022. 11(21): 3378.

33. Chi Xuelu, Guo Hongxia, Zhang Yangdong, Zheng Nan, Liu Huimin,

Wang Jiaqi. E-nose, E-tongue combined with GC-IMS to analyze the

influence of key additives during processing on the flavor of infant

formula.

Foods. 2022. 11(22): 3708.

█ MRT 2022 年度报告

﹣10﹣

34. Wang Ziwei, Gao Yanan, Huang Shengnan, Wang Jiaqi, Zheng Nan.

Ex vivo and in vitro studies revealed underlying mechanisms of

immature intestinal inflammatory responses caused by aflatoxin M1

together with ochratoxin A.

Toxins (Basel). 2022. 14(3): 173.

35. Gao Yanan, Yang Xue, Wang Jiaqi, Liu Huimin, Zheng Nan. Multiomics reveal additive cytotoxicity effects of aflatoxin B1 and aflatoxin

M1 toward intestinal NCM460 cells.

Toxins (Basel). 2022. 14(6): 368.

36. Gao Yanan, Wu Chenqing, Wang Jiaqi, Zheng Nan. Metabolomic

analysis reveals the mechanisms of hepatotoxicity induced by aflatoxin

M1 and ochratoxin A.

Toxins (Basel). 2022. 14(2): 141.

37. Zheng Nan, Min Li, Li Dagang, Tan Sheng, Gao Yanan, Wang Jiaqi.

Occurrence of Aflatoxin M1 in Cow, Goat, Buffalo, Camel, and Yak

Milk in China in 2016.

Toxins (Basel). 2022. 14.

38. Dong Lei, Meng Lu, Liu Huimin, Wu Haoming, Schroyen martine,

Zheng Nan, Wang Jiaqi. Effect of cephalosporin treatment on the

一、成果概览 █

﹣11﹣

microbiota and antibiotic resistance genes in feces of dairy cows with

clinical mastitis.

Antibiotics (Basel). 2022. 11(1): 117.

39. Su Chuanyou, Qu Xueyin, Gao Yanan, Zhou Xuewei, Yang Xue,

Zheng Nan. Effects of heavy metal exposure from leather processing

plants on serum oxidative stress and the milk fatty acid composition of

dairy cows: a preliminary study.

Animals (Basel). 2022. 12(15): 1900.

40. Huang Shengnan, Gao Yanan, Wang Ziwei, Yang Xue, Wang Jiaqi,

Zheng Nan. Anti-inflammatory actions of acetate, propionate, and

butyrate in fetal mouse jejunum cultures ex vivo and immature small

intestinal cells in vitro.

Food Science & Nutrition. 2022. 10(2): 564-76.

41. 赵艳坤, 刘慧敏, 孟璐, 王成, 王加启, 郑楠. 大肠埃希菌异质性

耐药的研究进展[J].

生物技术通报. 2022. 38(09):59-71.

42. 常嵘, 叶巧燕, 刘慧敏, 郝欣雨, 郭洪侠, 郑楠. 牛奶中激素检测

方法的研究进展[J].

█ MRT 2022 年度报告

﹣12﹣

食品安全质量检测学报. 2022. 13(16):5235-5243.

43. 杨丽婷, 王子微, 王加启, 郑楠. 短链脂肪酸及其调节肠道炎症作

用的研究进展[J].

食品工业科技. 1-23.

44. 郝欣雨, 陈美霞, 刘慧敏, 臧长江, 郑楠, 王加启. 不同储运条件

对 UHT 灭菌乳中糠氨酸含量的影响[J].

中国乳品工业. 2022. 50(08):31-34.

45. 迟雪露, 刘慧敏, 叶巧燕, 郑楠, 王加启. 奶中风味物质检测技术

研究进展[J].

中国乳品工业. 2022. 50(04):40-45+56.

46. 黄胥莱, 高亚男, 张养东, 王加启, 郑楠. 食品中锶功能的研究进

展[J].

食品科学. 2022. 1-15.

47. 杨雪, 高亚男, 王加启, 郑楠. 短链脂肪酸的功能研究进展[J].

食品科学. 2022. 1-16.

（二） 著 作

1. 中国奶业质量报告（2022）. 中国农业科学技术出版社

2. 青贮饲料制作与质量安全控制技术. 中国农业科学技术出版社

一、成果概览 █

﹣13﹣

3. Frontiers in Dairy Cows Nutrition and Milk Quality. 中国农业科

学技术出版社

4. 奶牛养殖减抗技术指南. 中国农业出版社

5. 奶牛学. 中国农业出版社

6. 复原乳. 中国农业科学技术出版社

7. 即食生乳及其制品. 中国农业科学技术出版社

8. 牛奶对健康的双重营养功能-婴幼儿篇. 中国农业科学技术出版社

9. 牛奶对健康的双重营养功能-青少年篇. 中国农业科学技术出版社

10. 牛奶对健康的双重营养功能-中青年篇. 中国农业科学技术出版社

11. 牛奶对健康的双重营养功能-老年篇. 中国农业科学技术出版社

12. 牛奶对健康的双重营养功能-孕妇篇. 中国农业科学技术出版社

（三） 发明专利

1. 赵圣国；王加启；郑楠. 一种化合物及其在改善动物瘤胃微生物发

酵中的用途. ZL 20211062703.1

2. 赵圣国；王加启；郑楠；张晓音. 一种生物碱类化合物及其在改善

动物瘤胃微生物发酵中的用途. ZL 202110626888.X

3. 赵圣国；王加启；郑楠. 调控反刍动物瘤胃微生物发酵的植物源天

然化合物及其应用. ZL 202110684164.2

█ MRT 2022 年度报告

﹣14﹣

（四） 标 准

1. 刘慧敏、叶巧燕、郑楠、王加启、屈雪寅、张宁、郭梦薇、郭洪侠、

迟雪露. 婴幼儿配方乳粉中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的测定 凝

胶色谱法. T/TDSTIA 025-2022. 团体标准

2. 郑楠、张永久、张养东、王加启、孟璐、刘慧敏、李雪、屈雪寅.

婴幼儿配方乳粉新鲜度. T/TDSTIA 027-2022. 团体标准

3. 解庆刚、王象欣、屈雪寅、刘慧敏、王坤、赵昕、杨惠秀、郑楠.

婴幼儿食品和乳品中骨桥蛋白的测定 高效液相色谱法 .

T/TDSTIA 028-2022. 团体标准

4. 屈雪寅、赵昕、刘慧敏、刘龙飞、郑桂亮、张彩霞、徐红、王坤、

杨惠秀、郑楠. 乳及乳制品商业无菌检验 三磷酸腺苷生物荧光法.

T/TDSTIA 029-2022. 团体标准

5. 赵圣国、郑楠、张养东、刘慧敏、王加启、田锦秀. 饲料用缓释包

被尿素. T/TDSTIA 030-2022. 团体标准

二、研究进展 █

﹣15﹣

二、研究进展

█ MRT 2022 年度报告

﹣16﹣

领域一：奶牛健康养殖与牛奶品质形成机理

1. 宏基因组指导未培养微生物分离培养的机遇与挑战

宏基因组指导未培养微生物分离培养方法

二、研究进展 █

﹣17﹣

摘要

宏基因组测序技术让人们对地球上微生物的多样性有了更深入

的了解，但分离培养是研究微生物的生理代谢功能并解析其生态作用

的关键。目前环境中的大多数微生物仍未被分离培养，因此，分离未

培养微生物是当前研究的首要任务。分离的微生物菌株可用于开发新

的益生菌、生物调控剂和农业工业添加剂等。当前，宏基因组数据日

益丰富，为指导靶标微生物的分离和培养带来了新的机遇。本文介绍

了基于宏基因组数据分离和培养靶标微生物的新方法及应用，主要包

括特定培养条件的设计、特异性抗体捕获分离、靶向基因筛选分离等

技术。通过未培养微生物基因组信息预测其代谢特征和生长需求，为

分离培养新的微生物并解析其功能特征提供了突破机遇。

1 前言

微生物是地球上已知的最早生命形式，其生存的历史可追溯到30

多亿年前。微生物的多样性很高，存在于几乎所有的环境如土壤、海

洋等，以及宿主体内，例如动物肠道、植物根际等，它们与宿主共同

进化并与宿主的健康和相关功能紧密关联。微生物具有巨大代谢和生

理多样性，在地球上几乎所有生物化学循环过程中都是必不可少的。

此外，微生物与宿主相互作用在自然界中广泛存在，微生物可以帮助

宿主吸收或合成机体必需的营养物质，分解代谢机体无法消化的底物，

另外，微生物自身也可以作为营养来源被宿主利用。它们还可以保护

█ MRT 2022 年度报告

﹣18﹣

宿主免受病原体和有毒物质的侵害，调节寄主的生理功能，包括免疫、

发育、甚至社会行为。随着 DNA 测序技术的不断发展，改变了我们

对地球上微生物多样性的认识，特别是细菌和古菌。同时，这些研究

也揭示了大多数微生物物种仍未被培养，其中包括很多优势物种。因

此，目前我们对微生物的了解，部分来自少数已被分离培养的物种，

部分来自测序获得的基因组数据。虽然基于测序技术为微生物的多样

性和功能提供了很多重要的新见解，但获得重要的未培养微生物的纯

菌株对于直接评估其代谢和生理功能以更好地理解它们在自然环境

中的生物学和生态学作用至关重要。

随着“组学”的不断发展，人们认识到培养微生物的重要性，在

过去的十年里，将未被培养的微生物“暗物质”进行分离培养越来越

受研究者的关注。传统的非靶向微生物培养方法和高通量培养方法如

培养组学分离了许多新的和未被培养的微生物。但这种方法费时，需

要消耗很多材料，并且不一定能捕获群落中重要的靶标微生物群。因

此，通过靶标微生物的基因组数据，确定其独特属性以制定分离策略

具有重要的应用前景。基于宏基因组测序或单细胞测序获得微生物的

基因组，对靶向分离微生物具有巨大的潜力，这种方法充分挖掘并利

用了未培养微生物的生物和遗传资源。本文对利用宏基因组数据指导

的微生物分离培养方法的研究进展进行了综述。

二、研究进展 █

﹣19﹣

2 未培养微生物

目前估计的全球微生物多样性仍存在很大争议，基于 16S rRNA

基因数据集估算全球细菌和古细菌的多样性，预测存在 220-430 万个

原核生物可操作分类单元（OTUs；以 97%相似性进行聚类）。但全

球原核生物的数量远超过该数字，因为这些研究中无法获得物种的基

因组和菌株表型多样性的数据。此外，真菌、原虫和其他单细胞真核

生物等重要微生物类群在多样性估算中经常被忽略，但它们对微生物

生态系统的功能具有重要贡献。目前，已被培养的细菌物种大多来自

四个细菌门：拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门和放线菌门。这些细菌

门在肠道微生物群落中占主导地位，这可能是由于人们对人类肠道菌

群研究较多。此外，据估计，全球微生物群落中，未被培养的微生物

属和门分别占 81%和 25%。环境中未培养的微生物物种占主导位置，

具有重要的生态作用，因此深入了解它们的生物学特性对于揭示它们

对生态系统的贡献是至关重要的。在过去十年中，从不同环境中分离

和培养微生物的进展缓慢，因为人们对大多数微生物生长所需的复杂

因素仍不了解，导致无法在实验室进行分离培养。微生物生长的自然

环境通常是复杂的，并且不同微生物物种生长的最适 pH 值、温度、

压力以及未知生长因子等参数各不相同，因此很难模拟其营养需求。

此外，一些微生物生活在厌氧或其他极端环境中，这需要在实验室配

置相关的专业设备。有些微生物在自然界中以休眠状态存在，导致在

█ MRT 2022 年度报告

﹣20﹣

实验室中难以分离培养。在自然环境中，有些微生物需要交叉喂养或

与宿主及其他群落成员进行相互作用。环境中一些低丰度或稀有微生

物，需要进行富集后才能被分离，同时也需要其他强有力的筛选和分

析方法。分离生长缓慢的细菌是一项具有挑战性的任务，因为在体外

分离时，这些细菌可能无法与快速生长的细菌相竞争。

3 微生物培养的重要性

纯菌株是直接研究微生物功能的重要生物资源，可通过功能表型

特征鉴定基因组预测的新基因，从而提高基因注释的准确性。纯菌株

还可构建参考基因组，联合参考基因组、宏基因组及宏转录组数据可

进一步解析微生物群落的功能。此外，纯菌株能为生物产业或健康产

业提供新的生产思路和生物资源。

纯菌株可以研究微生物在特定条件下的代谢活性，揭示其未知的

生理特性。这些特性无法从基因组数据中推断出来，因为基因组信息

是无法确定哪些基因可以表达的，也无法确定不同基因产物之间的相

互作用以及不同环境条件对基因表达的影响。有研究通过对纯菌株进

行试验，发现了新的生化途径和酶促反应，而这些功能信息通过基因

组数据是无法获得的。宏基因组学是解析未培养微生物强有力的工具，

让科学家提出了很多新的假设，但活的纯菌株是验证这些假设的重要

资源。此外，物种间的相互作用、进化原理、种群动态和致病性也只

有通过纯菌株才能得到证实。微生物纯培养物还可应用于工业生产、

二、研究进展 █

﹣21﹣

益生菌开发等生产中。未来可收集代表性培养物构建微生物资源库，

实现资源共享，用于开发新的生物技术。

微生物纯培养物可丰富参考基因组数据库和系统分类，这将进一

步增加对生态系统中微生物功能的认识。目前在 KEGG 等基因数据

库中，几乎有一半的基因功能无法确定，此外，很多注释是不准确的。

通过微生物纯培养对鉴定的基因进行功能验证，将大大提高注释范围

和准确性，从而进一步提高未培养微生物的可培养性。此外，微生物

分类是描述微生物多样性的核心。目前，国际原核生物命名规则是基

于可培养微生物进行，未培养微生物无法被正式命名。虽然为了改变

这一现状，有研究者提出通过 DNA 序列作为微生物命名的依据，但

如果没有该新物种可培养的代表菌株，则不能在分类学上进行准确的

描述。此外，有研究者建议开发一个未培养原核生物的命名代码，将

未培养微生物的分类整合到现有分类框架中。

有些微生物无法单独生长，因此富集培养和共培养对了解这些微

生物也很有价值。富集培养是通过设计特定的生长条件，优先刺激特

定微生物的生长，来提高样品中特定微生物类群的丰度。如果目标微

生物的生长依赖于其他微生物，例如交叉喂养（一种微生物的代谢产

物作为另一种微生物生长的底物），则需要将两种或多种微生物进行

共培养。

█ MRT 2022 年度报告

﹣22﹣

未培养微生物分离培养的意义

4 宏基因组数据重建微生物基因组及其代谢途径

宏基因组学是对微生物群落中所有基因组进行研究，通常采用鸟

枪法测序对微生物进行物种分类和功能注释。宏基因组序列组装是指

将每个 DNA 序列拼接在一起，这是基因组分析的一个关键步骤。宏

基因组组装基因组（MAGs）是通过对具有相似特征的 contigs 进行分

箱和质量控制生成的。

短读长测序技术(NGS)如 Illumina 测序，因其高通量和低成本而

广泛应用。微生物基因组可以通过短读长测序数据进行组装，但宏基

因组组装的基因组会受到重复元件的限制，而长读长测序可能克服这

一问题。长读长序列可以跨越 16S rRNA 基因、微型倒置重复转座元

验证功能基因

验证互作关系

揭示代谢特征

开发新生物技术

构建种质资源库

揭示功能机制

二、研究进展 █

﹣23﹣

件、转座子、基因复制和原噬菌体序列等常见的重复元件，显著提高

MAGs 的组装质量。随着测序技术的不断发展，长读长测序技术如单

管长片段序列(stLFR)、PacBio 和 Nanopore 等已得到应用。这些技术

已成功从土壤、淡水湖和人类粪便等样本中重建了完整的或单个环状

的基因组。虽然 MAGs 已经成为宏基因组数据分析流程中的标准方

法,但它在 16S rRNA 基因、生物合成基因簇(BGCs)、潜在污染、嵌合

基因、染色体或基因缺失、区分多个染色体和染色体外成分的能力上

仍有局限。使用长读长测序技术和新的分箱算法可提高 MAGs 的质

量，有时可以产生完整的环形 MAG，从而提高功能注释和代谢途径

重塑的效率。

除了宏基因组测序，单细胞测序是另一种获得微生物基因组信息

的方法。单细胞测序是对环境样本中的单一细胞进行测序得到其基因

组信息，该方法在本文中也进行了讨论，因为该方法同样可以获得未

培养微生物的基因组信息。该技术已经发展成熟，目前可进行高通量

测序，一次试验可得到数百个高质量的微生物单细胞基因组(SAG)，

对指导分离尚未培养的微生物提供基因数据。

将 MAGs 或 SAGs 预测的基因进行功能注释，重建微生物的代

谢途径，对于理解微生物潜在功能至关重要，可帮助实现微生物的分

离培养。宏基因组功能注释包括两个步骤:基因预测和基因注释。基因

█ MRT 2022 年度报告

﹣24﹣

注释常用的数据库包括 KEGG、EggNOG、dbCAN、RGI、GO、COG、

MetaCyc、BioCyc、Brenda、Rhea、EcoCyc 等。

基于公共数据库中现有的参考代谢途径，可以基于微生物蛋白质

序列的同源性进行比对，预测和重建微生物代谢途径。目前重建代谢

途径的方法包括:BlastKOALA、KAAS、GhostKOALA 和 RAST。然

而，仍有许多代谢途径无法被识别，或代谢途径中的部分环节无法被

识别，仅能构建出一个不完整的代谢途径。此外，这些方法不能预测

参考途径中不存在的新反应或酶。为了避免出现上述情况，需要对基

因间的联系有充分了解，如基因-基因间的相互作用，然后根据微生物

的功能和系统发育分析进行分类。通过解析这些数据，确定微生物的

营养和生长需求，指导未培养微生物分离和培养。

基于微生物的基因组信息，可以设计分离未培养微生物的方法或

策略。这些方法与传统的非靶向和高通量培养方法如培养组学、原位

培养、单细胞分离和 iChip 可相互补充。宏基因组数据分析方法和新

培养方法的不断发展，为开发设计靶向分离目标种类或功能微生物的

方法提供了新思路。

5 宏基因组数据指导的微生物分离方法

5.1 优化培养基

二、研究进展 █

﹣25﹣

了解营养需求和代谢特性对未培养微生物分离和培养是至关重

要的。宏基因组数据提供了微生物代谢、底物利用、氧需求、抗生素

耐药性等信息，也提供了微生物与宿主相互作用信息，为微生物培养

基和生长条件的设计提供了理论依据(图 1)。然而，通过基因组数据

了解目标微生物的生理特征并不容易，这需要深厚的代谢途径和生理

学知识背景。但是，这些方法已经成功用于海洋和肠道等不同环境中

分离和培养新的微生物。

Tyson 等通过解析酸性矿井排水生物膜的宏基因组数据，设计改

良培养基成份，成功分离到一株 参与固氮的钩端螺旋体

（Leptospirillum）。钩端螺旋体（Leptospirillum）基于 16S rRNA 基

因被分为 I、II、III 三类。在该研究之前，已经得到了 I 类和 II 类的

代表菌株，但 III 类的代表菌株仍未被分离培养。Tyson 等人在 III 类

钩端螺旋体（Leptospirillum）的基因组中发现 nif 基因操纵子，这在

II 类中是缺失的。作者推断，同样存在于生物膜中的 II 类钩端螺旋体

（Leptospirillum）缺乏固氮基因。因此，作者设计了无氮培养基，成

功分离出第一个 III 类钩端螺旋体（Leptospirillum）的代表菌株。

当摄入相同的能量时，食草性塔玛沙袋鼠(Tammar wallaby,

Macropus eugenii)比反刍动物瘤胃产生的甲烷少很多，研究显示食草

性塔玛沙袋鼠(Tammar wallaby, Macropus eugenii)的肠道微生物群组

成独特，来自琥珀酸弧菌科(Succinovibrionaceae)的 OTUs 与甲烷产量

█ MRT 2022 年度报告

﹣26﹣

相关。Pope 等人利用 MAG 数据，部分重建了琥珀酸弧菌科

(Succinovibrionaceae)WG-1 的氮和碳利用途径及抗生素耐药性。预测

发现 WG-1 的碳水化合物发酵底物为淀粉，其基因组中包括脲酶基因

簇，编码运输和代谢尿素所需的所有基因（13 个）。根据这些信息，

作者设计了一种培养基，以淀粉和尿素作为唯一的碳源和氮源。基因

组中包含一个杆菌肽抗性基因，所以在培养基中添加了杆菌肽。作者

成功利用该培养基从袋鼠食糜样品中富集 WG-1，并通过稀释平板法

分离到纯菌株。该研究对 WG-1 的底物利用和培养发酵进行了详细的

描述，对研究细菌与产甲烷菌的营养互作提供了基础。

宏基因组测序能鉴定新微生物生长所需的特定底物，利用该信息

设计培养条件从而实现对新物种的分离培养。Lugli 等人利用该方法

成功从动物粪便样品中分离出新的双歧杆菌。首先，对宏基因组数据

进行组装，然后将预测的基因与糖基水解酶(GH)数据库进行比对，评

估双歧杆菌可发酵的多糖。作者预测新双歧杆菌发酵碳源为阿拉伯半

乳聚糖、支链淀粉、淀粉和木聚糖四种多糖。因此，作者分别利用上

述碳源作为唯一碳源设计培养基，进行分离培养试验。结果培养出了

13 株表型不同的双歧杆菌分离株，其中 2 株为新的双歧杆菌。

Karnachuk 等人从水井深水层分离了一种嗜热螺旋体，命名为 BY33，

是属于 Brevinematales 的一个新科。首先，作者从深水层的宏基因组

数据集中鉴定出了一种新的 MAG。通过基因注释发现了编码利用淀

二、研究进展 █

﹣27﹣

粉和麦芽糖/麦芽糖糊精 ABC 运输系统的基因，可摄取胞外淀粉的水

解产物。最后，利用添加麦芽糖和淀粉的改良螺旋体培养基进行富集

和培养，成功分离出 BY33。Renesto 等人通过基因组分析发现，

Tropheryma whipplei 在氨基酸生物合成方面存在代谢缺陷。

Tropheryma whipplei 的基因组中缺乏 9 种氨基酸的合成途径(组氨酸、

色氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和天

冬酰胺)，表明 T. whipplei 需要从外部环境中获取这些氨基酸或其前

体物。因此，作者设计了一种包含这些氨基酸的培养基，并成功分离

出了之前培养过的3株T. whipplei，并从临床样本中分离出1株新菌。

虽然该例子仅是利用了基因组序列数据，但这种方法可以应用于未培

养的 SAGs 和 MAGs 数据。

解析微生物的最适生长条件也是分离培养微生物的一个重要因

素。David 等人报道了一种工具，可以根据微生物的基因组信息预测

其最佳生长温度。作者指出，同样的原理可以应用于其他的因素，比

如温度、pH 值、盐浓度、渗透压或氧浓度等。这些信息对于从极端

环境中分离微生物例如嗜冷菌、嗜热菌、耐高盐菌等是至关重要的。

█ MRT 2022 年度报告

﹣28﹣

基于特定培养条件的设计分离靶标微生物的方法流程

5.2 使用抗生素

微生物对抗生素的抗性表型直接与特定的微生物类群相关联。宏

基因组学和网络分析能够分析微生物群的抗生素耐药基因(ARGs)及

其共现模式(图 1)。因此，可以通过该方法检测和评估不同微生物分

类群对抗生素耐药性特征。绘制微生物的抗生素抗性图谱，可以有针

对性地分离未被培养的特定微生物类群。Rettedel 等人利用该方法揭

示了人类肠道菌群中 16 种抗生素耐药表型的分布特征。利用不同组

合抗生素的培养基，作者分离了四种微生物，其中两种是属于

二、研究进展 █

﹣29﹣

Oscillibacter 属的新物种。在 Pope 等人的研究中，组装的 WG-1 基因

组中发现了杆菌肽抗性基因，作者在设计的培养基中添加杆菌肽，最

后也成功分离出 WG-1。因此，抗生素抗性表型在分离培养中具有重

要指导意义。

5.3 稳定性同位素标记辅助拉曼活性微生物细胞分选（RACS）

另一种分离新微生物的方法是利用稳定性同位素探针标记的拉

曼活性微生物细胞分选，该方法能够获得可培养的活细胞(图 1)。通

过宏基因组数据可获得微生物的代谢、底物利用、氧需求、抗生素耐

药性等性状的信息，根据这些信息可针对靶标微生物设计培养基并创

造其最适的生长条件。已有研究证明，拉曼显微镜技术结合氘同位素

探针(DIP)可以在特定的培养基中识别具有代谢活性的靶标细菌。因

此，可以通过基于 MAGs 或 SAGs 信息设计特定的培养基，在使用稳

定性同位素氘标记的重水(D2O)中培养靶标细菌。D2O 是一种有效的

DIP 探针，它的 C-D 波段在拉曼光谱检测时会在 2000-2300cm-1 产生

偏移。当微生物样品在含有特定代谢底物和 D2O 的培养基中培养时，

具有代谢活性的细菌会在单细胞拉曼光谱中产生 C-D 波段偏移，基

于单细胞拉曼光谱，利用 RACS 便可分离具有代谢活性的靶标微生

物。

Yi 等人使用 RACS 技术从人体肠道微生物群中原位检测具有代

谢活性的耐药菌群。取粪便样品在添加 40% D2O (v/v)和抗生素(阿莫

█ MRT 2022 年度报告

﹣30﹣

西林、头孢氨苄、氟苯尼考、四环素和万古霉素)的 PBS 中培养 24 小

时(37 ) ℃ 。他们成功地分选出六种微生物类群，包括两种阿莫西林耐

药菌(AmoxR)、两种头孢菌素耐药菌(CephR)和两种头孢菌素敏感菌

(CephS)。Kang 等人利用这种方法对小鼠肠道中分解粘蛋白的细菌进

行分选。将小鼠结肠内容物悬浮于含 50% D2O 的 PBS 和粘蛋白中，

厌氧孵育后利用 RACS 分选出一类可降解粘蛋白的菌群，其中包括

Muribaculaceae 科的多个新菌。

只要微生物细胞在拉曼光谱中有特定的峰，RACS 平台就可以通

过相应的参数对这一类细胞进行分类。例如，Yun 等人利用 13C 和 15N

从口腔分离出五种不同类型的细菌。这些研究表明拉曼活细胞分选技

术在靶向识别和分离特定代谢过程中的关键微生物方面具有潜力。

5.4 反向基因组（特异性抗体）指导微生物分离

Cross 等人介绍了一种基于基因组信息设计和制备特异性抗体的

分离方法，通过荧光标记的特异性抗体结合细胞分选技术可从复杂微

生物群落中分离新的微生物，这一方法被称为反向基因组学（reverse

genomics）。该方法使用特异性抗体，能够有效地标记靶细胞，同时

保留其培养活性(图 2)。该方法流程如下,根据未培养的微生物基因组

数据的 MAGs 或 SAGs 信息确定感兴趣的菌株,预测靶标微生物基因

编码的膜蛋白与细胞外的抗原表位，合成抗原蛋白后制备特异性抗体，

二、研究进展 █

﹣31﹣

然后用荧光标记抗体。被标记的抗体与靶标微生物的样本结合，利用

荧光细胞分选技术从样品中分离被荧光标记的靶标微生物细胞。该方

法可使靶细胞在整个分选过程中保持活性，可用于后续的培养和功能

验证等试验。

Cross 等人利用该方法从人唾液样本中分离培养了

Saccharibacteria (TM7)的三个不同物种。作者利用唯一的 TM7 基因

组，基于 IMG 数据库(https://img.jgi.doe.gov)注释编码膜蛋白的基因。

利用TMHMM v.2.0分析锚定跨膜螺旋结构域，排除假设的和短于100

个氨基酸的蛋白。剩余序列与从人类口腔微生物组数据库中

(http://www.homd.org/)下载的所有口腔细菌的蛋白质组数据进行比对

分析。随后分析候选靶标序列跨膜结构域的数量、预测的胞外结构域

的数量、大小与丰度以及与免疫相关的实验数据。排在首位的是 PBP2，

PBP2 的高分辨率晶体结构和抗 PBP2 抗体与致病菌细胞表面结合的

研究均已被报道。利用 ABCpred59、BepiPred60、IEBD Analysis

Resource (http://tools.immuneepitope.org/bcell)和 Bio-Synthesis peptide

design tools (https://www.biosyn.com)对蛋白序列进行抗原区域和亲水

性分析。抗原肽通过商业途径生物合成，在 C 端(PBP2)添加半胱氨

酸，纯化后注射于兔体内。HiTrap Protein A HP 抗体纯化柱(GE BioSciences)纯化 IgG。Alexa Fluor 488 Antibody labeling Kit (A20181)试

剂盒对 IgG 荧光标记。荧光标记的抗体与样品孵育后，利用流式细胞

█ MRT 2022 年度报告

﹣32﹣

仪分选被标记的靶标微生物，随后通过平板分离培养靶标微生物。为

了测试该方法的适用性，作者选择了一个没有 3D 结构和抗原-抗体试

验数据的蛋白质 CpsC。作者在口腔细菌基因组数据库中没有发现与

CpsC 同源性超过 30%的蛋白。Cross 等人首次分离培养了人口腔样本

中丰度较低的 SR1/Absconditabbacteria。反向基因组学分离微生物的

方法对分离未培养的感兴趣的微生物特别是生长缓慢、丰度低和稀有

的物种具有很大的应用潜力。

基于反向基因组学的方法分离靶标微生物的方法流程

5.5 靶向功能基因分离策略

二、研究进展 █

﹣33﹣

宏基因组数据可以检测功能基因的变异、低丰度和稀有物种，用

以分离携带靶标基因的微生物。Ma 等人描述了一种基于宏基因组测

序数据分离培养携带靶标基因微生物的方法。该方法使用带有纳米孔

的微流体装置进行，该装置可将每个单菌隔开独立生长，主要包括两

个步骤:首先确定靶标微生物的培养条件然后进行分离。将样品在生

长介质中稀释使在微流控芯片的每个孔中最多只有一个细胞。为了避

免一个孔中出现多个细胞，需保证一定数量孔是空的。培养一段时间

后，微流控芯片可将每个菌落分成 2 份，其中 1 份用于对靶标基因进

行 PCR，以确定靶标微生物。将样品置于芯片上进行培养，然后通过

PCR 筛选，确定含有靶标微生物的孔，从芯片的另一份对应的孔中取

出样品进行富集培养（图 3）。Ma 等人利用该方法分离培养了来自

人盲肠中来自瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）的一个新属代表菌。这

种方法克服了不同微生物生长动力学的偏差，试验装置体积小可节约

试验材料，并可置于厌氧箱分离厌氧菌，比如肠道菌群。微体积培养

的难点是气体基质的提供。但是，最近出现的微液滴供氧新方法或许

可以应用于微体积培养。

荧光原位杂交(FISH)标记的样品可以利用荧光激活细胞分选

(FACS)进行分类以富集被标记的细胞，因此可利用宏基因组序列信

息对目标微生物设计探针，从而实现目标微生物的富集分离培养。然

而，标准的 FISH 程序需要对样品进行固定，使微生物失去活性无法

█ MRT 2022 年度报告

﹣34﹣

进行分离培养。有研究通过修改 FISH 程序，去除了固定的步骤，改

进后的程序可保留微生物的活性，用于后续分离培养试验。Tan 等人

通过宏基因组测序数据设计 FISH 探针，用于分离污水处理厂样本中

的微生物。探针以 V6 的高可变区域序列为模板进行设计，长度 33bp,

通过设计的探针和 FISH–FACS 成功的富集了一个鞘脂杆菌目

（Sphingobacteriales）的新细菌分类单元(UPWRP_1)。基于高可变区

域序列信息设计的探针可鉴定到菌株水平，结合 FISH 活细胞分选，

可以分离培养靶标微生物。

一些抗生素通过直接与细菌表面结构结合发挥作用，因此可将其

作为细菌标记探针用于分离特定种类的微生物。该方法已分别在体外

和体内被应用于鉴别不同的细菌种类。

此外，基因组编辑技术也可用于分离新的靶标微生物。基于

MAGs 序列信息对特定基因进行编辑，改造靶标微生物基因组，结合

含有选择性抗生素或底物的培养基，分离编辑后的靶标微生物(图 3)。

Rubin 等人通过编辑微生物群落中特定微生物的基因组并对其进行分

离，从而验证了该方法的适用性。作者利用 VcDART 转座子设计了

缺失 pyrF 基因的克雷伯菌（Klebsiella michiganensis）和假单胞菌

（Pseudomonas simiae）突变株。突变株包含携带两种抗生素抗性基

因的转座子，分别对链霉素、大幕霉素和青霉素耐药。通过该方法，

作者成功富集了目标微生物（丰度达 99%）。此外，对靶标微生物的

二、研究进展 █

﹣35﹣

乳糖同化基因进行编辑，并在生长培养基中添加乳糖作为唯一碳源，

成功富集了靶标微生物使其丰度达到 95%。基因编辑技术指导的富集

方法也具有很高的特异性，可以区分同一物种中的不同菌株，例如大

肠杆菌的亚群 2 和 3。

基于靶标基因靶向分离微生物方法流程

6 挑战与局限性

虽然已经有许多研究利用宏基因组数据成功地分离和培养了靶

标微生物，但想要分离更多的微生物，仍存在一些挑战和局限性。反

向基因组（特异性抗体）为靶向分离培养微生物提供了一个新机会，

但该方法仍存在一些局限性。首先，有些微生物无法确定合适的胞外

抗原表位，可根据亲缘关系相近物种的同源基因进行预测，但该方法

█ MRT 2022 年度报告

﹣36﹣

仅对部分微生物有效。其次，如果目标膜蛋白的表达水平低则无法获

得其抗体，可通过基因表达和蛋白质组学数据鉴定高表达量的膜蛋白。

最后，靶标抗原表位如果存在翻译后修饰如糖基化，可能会阻碍抗体

的识别。为了避免上述问题，进行试验时可以选择多个抗原表位，或

者使用整个蛋白结构域，但可能会降低特异性。

利用细胞分选方法分离靶标厌氧微生物更具有技术挑战。由于细

胞分选仪器较大，很难放入厌氧箱，因此，可开发在厌氧条件下使用

的荧光细胞分选仪器。分离到靶标微生物后，需确定其合适的生长介

质和培养条件。但是，微生物栖息的自然生态环境组分是复杂的，甚

至有些成份是未知的，有些微生物单靠基因组序列不能提供足够的信

息来准确地确定其生长所需的所有必要条件。例如，Lavy 等人根据

Poribacteria sp. WGA-4E 的基因组数据设计了一种培养基。虽然根据

基因组数据预测了该细菌门的代谢特性，比如以尿素为氮源，能同化

硫酸盐，但根据这一信息设计的特定培养基并没有捕获到靶标菌株。

Poribacteria 菌的生长除了上述所需的营养成分，可能还需要某些未

知的信号分子。将宏基因组学方法与培养组学、原位培养、单细胞分

离、析因试错法等相结合，将提高成功分离培养靶标微生物的机会。

基于基因组数据设计目标微生物的培养策略，很大程度上依赖于

提取的 DNA 质量，但可能存在细胞裂解、DNA 提取不完全或 DNA

降解等问题，这可能会影响某些物种在宏基因组数据中的代表性。单

二、研究进展 █

﹣37﹣

细胞基因组学是重建靶标微生物基因组的另一种方法，但这需要更专

业的细胞分离、基因组扩增、测序和分析技术。

7 结论

DNA 测序技术的快速发展揭示了自然界中存在大量尚未培养的

微生物。目前面临的挑战是利用这些数据指导未培养微生物的分离，

探索微生物在其自然栖息地的生态特征。宏基因组测序不仅揭示了微

生物组的种类和功能特征，还为分离和培养微生物提供了新的思路和

策略，具有很大的应用潜力。随着长读长 DNA 测序技术的进展、测

序深度的增加和生物信息学方法的更新，MAGs 的质量不断提高，使

基因注释和代谢途径预测更加准确。基于这些数据设计特定培养基、

特异性抗体和靶基因或探针的培养方法，从不同环境中分离出多种微

生物。通过宏基因组数据指导微生物的分离方法，大大增加了成功培

养靶标微生物的机会。然而，靶向分离和培养的过程往往是复杂的，

需要深入解析基因组数据来预测微生物的培养条件，分离或分选过程

涉及的先进仪器和技术，有些微生物实验室不具备。靶向分离培养方

法可以节约目标微生物的分离时间。目前面临的挑战是如何利用丰富

的宏基因组数据实现高通量靶向培养。结合一些先进的新培养方法，

将有助于实现对未培养微生物分离培养的新突破。

（撰稿人：刘思佳，校稿人：张晓音）

█ MRT 2022 年度报告

﹣38﹣

LIU SIJIA, CHRISTINA D. MOON, ZHENG NAN, SHARON

HUWS, ZHAO SHENGGUO, WANG JIAQI.Opportunities and

challenges of using metagenomic data to bring uncultured microbes into

cultivation.

Microbiome. 2022, 10(1):76.

二、研究进展 █

﹣39﹣

2. 荷斯坦奶牛生乳总固形物含量的变化与瘤胃细菌群落有关

总乳固体（TMS）是乳脂、乳蛋白、乳糖和矿物质的总和，能够

直接反映生乳的质量，同时也是一些国家牛乳贸易的定价指标。TMS

的前体物质包括挥发性脂肪酸（VFA）、长链脂肪酸、氨基酸（AA）、

肽、葡萄糖、甘油等，这些物质主要通过瘤胃微生物分解日粮降解而

产生。因此，瘤胃中 TMS 前体物的生成量与乳腺的摄取量之间存在

关系。因此，提高 TMS 含量是提高生乳质量和奶牛生产效率的有效

措施。

影响 TMS 含量的因素有很多，如日粮、环境和动物遗传等。优

质粗饲料在全混合日粮（TMR）中的适当比例是保证 TMS 含量的关

键因素。季节对 TMS 存在一定影响，如夏季奶牛的 TMS 含量低于冬

季。Dechow 等人（2007）报道，杂交奶牛的 TMS 含量显著高于荷斯

坦奶牛。同样的品种，当奶牛饲喂相同的饲料时，饲料转化效率、产

奶量和乳蛋白产量存在较大的个体差异。了解导致这些个体差异的原

因对于提高 TMS 和牛奶质量很重要。已有研究发现，这些个体差异

与瘤胃细菌和瘤胃发酵密切相关。例如，饲料转化效率高的奶牛其埃

氏巨球菌的相对丰度显著高于饲料转化效率低的奶牛，而产奶量较低

的奶牛的链球菌、未分类肠杆菌科、反刍杆菌、密螺旋体和未分类类

█ MRT 2022 年度报告

﹣40﹣

杆菌科相对丰度均较高，表明瘤胃细菌在饲料转化为牛奶的过程中起

着关键作用。

本研究旨在探讨瘤胃细菌与 TMS 含量之间的关系。我们选择

TMS 含量高和低的奶牛，采用 16S rRNA 基因测序和实时定量 PCR

技术测定其瘤胃细菌群落的差异，并分析微生物与 TMS 含量的关系。

1 试验方法

1.1 试验动物分组和管理

本试验从 1500 多头荷斯坦奶牛中挑选 45 头体重、胎次（胎次为

1.30±0.74）、产奶天数（153±16d）和日产奶量（34±6kg）均相似的

健康泌乳奶牛，作为试验动物。使用 MilkoScan FT120 测定所有动物

的生乳样品（生乳采集见下文），如乳蛋白质、乳脂、乳糖和 TMS 含

量。根据先前的研究方法，将奶牛分为高 TMS（HS，TMS>平均数+0.7

SD）表型和低 TMS（LS，TMS<mean-0.7 SD）表型。本研究的目的

是探讨在产奶量相近的奶牛中，瘤胃细菌与 TMS 之间的关系。产奶

量的巨大变化可能会对 TMS 产生混淆影响。为了尽量减少两组之间

除 TMS 之外的其他潜在影响因素，本试验去除了每组中产奶量极高

或极低的奶牛。最后，每组中保留 6 头产奶量相似的奶牛（n=6）。

所有试验奶牛维持在相同的饲养条件下，饲喂相同的日粮。TMR

由玉米青贮饲料、苜蓿干草、苜蓿青贮、玉米、豆粕、桔皮颗粒、膨

化大豆和 DDGS 等组成，精粗比为 64：36。所有奶牛单独饲养，每

二、研究进展 █

﹣41﹣

天分别在 07:00、13:00 和 18:00 饲喂，自由饮水。每天记录奶牛的给

料量和剩料量，用于计算每头奶牛的日采食量。每天在 06:30、12:30

和 17:30 使用自动挤奶系统挤奶 3 次，每日产奶量由自动挤奶系统记

录。

1.2 样品的采集

14 天饲养期结束后，采集生乳样品和瘤胃液样品。按照 4:3:3 的

比例将上午、下午和晚上的生乳样品进行混合，作为一天的样品。每

头奶牛的瘤胃液样本（约 200 mL）在早晨挤奶后喂料前进行采集，

使用口腔胃管插入法采集。使用 pH 计立即测定 pH 值。然后，通过

4 层纱布过滤瘤胃液，并将其等分到 6 个灭菌管（5 mL）中，储存于

-80℃条件下，用于进一步分析。

1.3 指标的测定

取冷冻的瘤胃液样品分别对 VFA，氨态氮和微生物蛋白进行测

定。另取一份样品提取微生物总 DNA，并进行质量检测。以样品 DNA

为模板，用引物 341F (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和 806R (5'-

GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3-

V4 区域，并构建文库，然后于 Illumina Hiseq 2500 平台进行高通量测

序。针对上机测得的原始数据进行生信分析，得到每个样品中瘤胃细

菌的相对丰度。用数据统计分析对 HS 和 LS 组进行差异分析，用荧

光定量 PCR 技术对部分差异细菌进行定量分析。

█ MRT 2022 年度报告

﹣42﹣

2 结果与讨论

如表 1 所示所示，LS 奶牛的干物质摄入量比 HS 低 11.0%，此

外，HS 组的粗蛋白（CP）摄入量、中性洗涤纤维（NDF）摄入量和

酸性洗涤纤维（ADF）摄入量均显著高于 LS 组（P<0.01）。两组之

间的产奶量无显著差异（P=0.932）。HS 组 TMS 的含量和产量、乳

脂率、乳蛋白含量和脂蛋白比均显著高于LS组。所有试验奶牛的TMS

含量在 10.4%到 14.1%之间变异，之前有研究曾报道过奶牛个体间饲

料利用效率、氮利用效率和乳蛋白产量均存在较大的个体差异，这与

本研究的结果如出一辙。从结果中可以看出，HS 组 TMS、乳脂率和

乳蛋白含量较高的原因可能归因于奶牛的干物质采食量、粗蛋白、中

性洗涤纤维和酸性洗涤纤维采食量较高。

表 1 HS 组和 LS 组采食量和乳成分的差异

二、研究进展 █

﹣43﹣

两组之间的 pH、NH3-N 和 MCP 浓度没有显著差异，HS 组的丙

酸和戊酸浓度显著高于 LS 组（表 2）。TMS 的前体物在瘤胃中的产

生主要受日粮摄入量和瘤胃发酵的影响。在本研究中，我们发现 HS

组奶牛瘤胃总 VFA 浓度相对高于 LS 组奶牛，HS 组的 TMS 较高可

能是由于 VFA 浓度的差异，而 VFA 浓度的差异归因于 DMI（包括

CP、NDF 和 ADF 摄入量）变化引起的发酵速率的差异。VFA 是 TMS

的主要前体，因此 VFA 浓度越高，TMS 含量越高，这也解释了 HS

组奶牛乳脂含量显著高于 LS 组的原因。此外，单个挥发性脂肪酸的

摩尔百分比没有显著变化，这表明瘤胃发酵模式没有改变。pH 和 NH3-

N 的相似性表明，饲喂相同 TMR 的奶牛具有稳定的酸碱环境。两组

之间微生物蛋白的相似性解释了两组中乳蛋白没有差异的原因。

表 2 HS 组和 LS 组瘤胃发酵发酵参数的差异