科研用 hMSC 转导方案-mRNA

M40200 RoosterGEM™

仅限接收者科研使用

MBL BEIJING BIOTECH CO.,LTD. 咨询热线：400-000-9858

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方案概要

RoosterGEM 是一款化学成分限定的完全培养基，用于将慢病毒载体转染到间充质/基质细胞(hMSCs)，或

其他原代细胞中，无需额外添加其他培养基，即可提高转染效率。RoosterGEM 同样适用于提高 mRNA 的

转染效率。

RoosterGEM 培养基虽然可以单独使用，但我们对其进行的优化是基于 RoosterBio 产品体系，即使用

RoosterNourish™-MSC-XF（型号：KT-016，方案请通过代理商获取）培养基扩增培养 RoosterBio hMSC 细

胞，之后使用 RoosterGEM。一般流程建议概述如下。

图：与其他市售试剂相比，RoosterGEM 提高了 hMSCs 细胞的转染效率。

使用骨髓来源的间充质干细胞（RoosterBio 无异源（Xeno-Free）细胞产品 RoosterVial™hMSCs，型号：

MSC-031），验证了转染效率的提高。同时使用 CleanCap®增强型绿色荧光蛋白 mRNA（5-甲氧基尿苷）

(TriLink Biotechnologies)进行 mRNA 转染。

在 2D 贴壁培养表面进行脂质体介导的 hMSCs 转染

流程概述

细胞扩增概要

*在使用无异源（Xeno-Free）细胞产品及扩增培养基时，RoosterBio 强烈建议使用“Corning CellBIND 表面”、或用玻连蛋

白或纤维连接蛋白进行表面包被。

• 复苏并接种细胞，建议接种密度为：15,000-20,000 个细胞/cm2

，使用 RoosterNourish-MSC-XF 培养基扩

RoosterGEM 中的转染复合物 市售试剂#1 中的转染复合物

低脂质体 高脂质体 低脂质体 高脂质体

RoosterGEM中的细胞试剂#1中的细胞

第 0 天 第 2 天 第 3 天

PDL 8-10

RoosterVial-hBM/hUC1M-XF

接种密度为 15,000-20,000 个

细胞/cm2

使用 RoosterNourish-MSCXF

换用 RoosterGEM +

mRNA-脂质体，培养约

24 小时。

将 RoosterGEM 替换为

RoosterNourish-MSC-XF。

密切观察表达情况。

RoosterGEM™转染推荐工艺

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增培养，最多不超过 24 小时。

• 在 RoosterGEM + mRNA-脂质体复合物(0.4ml RoosterGEM/1.9cm2

)中培养培养物 16-24 小时。

• 替换为 RoosterNourish-MSC-XF。请勿冲洗微孔。

• 密切观察 mRNA 表达（约 48-72 小时）。

推荐方案

1.运输和储存

1.1.RoosterGEM 需冷冻运输，收到后立即将 RoosterGEM 储存在-20℃以下条件。

1.2.使用前，在约 2-4℃下避光解冻 RoosterGEM，直至无冰晶残留（通常为 24-48 小时）。

2.细胞培养

2.1.对于 24 孔 CellBIND 板，使用扩增培养基（RoosterNourish-MSC-XF，型号：KT-016），接种密度为

15,000 至 20,000 个 hMSCs/cm2

（每孔 2.9 万至 3.8 万个 hMSCs 细胞）。

2.1.1.注：建议使用 24 孔板优化表达。确定最佳条件后，可按比例调整工艺(0.4ml RoosterGEM/1.9cm2)。

2.2.如果需要，在转染步骤前进行更多孔铺板以计数每孔的细胞。

2.3.使培养物增殖 1 天。

3.培养基制备

3.1.将所需体积的 RoosterGEM 等分（24 孔板每孔添加 0.5ml）至单独的锥形管中，使其温度恢复至室温，

避光放置。

3.2.立即将未使用的 RoosterGEM 培养基放回至 2-4℃避光储存。

3.2.1.解冻后可储存 2 个月。

4.转染

注：对于初始筛选实验，使用 0.75 和 1.5µL Lipofectamine™ 3000。

4.1.使用计数仪对单个孔中的细胞进行计数。

4.1.1.从单个孔中抽吸 RoosterNourish-MSC-XF。

4.1.2.向 24 孔板的一个孔中加入 250µL TrypLE 酶。

4.1.3.将 TrypLE 酶均匀分布以覆盖所有细胞，并将培养瓶置于 37℃培养箱中。

4.1.4.每 5min 检查一次培养物，直至细胞从表面解离出来。

4.1.5.向各培养瓶中加入等体积的 RoosterNourish™-MSC-XF，以终止 TrypLE 酶活性。

4.1.6.将细胞悬液转移至适当的离心管中。

4.2.使用细胞计数仪进行细胞计数，如果计数仪对样品浓度有要求，可根据要求进行稀释。

细胞数量（每孔）

4.3.从剩余孔中吸出 RoosterNourish-MSC-XF。

4.4.替换为每孔

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0.4ml RoosterGEM。

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4.5.计算每 N 个反应所需的试剂量（24 孔板）：

每孔细胞计数

(=N)

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复合物体积

（24 孔中每孔

50µL）(V =

50µL*N)

Lipofectamine 3000

的量

（24 孔中每孔

1.5µL）

(A=1.5 µL*N)

mRNA 量

（24 孔中每孔 0.5µg）

(B=0.5 µg*N)

P3000 增强试剂量

（24 孔中每孔 1µL）

(C=1 µL*N)

4.6.使用 RoosterGEM 计算体积的一半(V/2)稀释 Lipofectamine 3000(A)计算的量。

4.7.使用 RoosterGEM 计算体积的一半(V/2)稀释 mRNA(B)和 P3000 增强剂(C)的计算量。

4.8.将 mRNA 混合物加入到 Lipofectamine 3000 混合物中。

4.9.室温下培养 5min。

4.10.向各孔中加入 50µL mRNA-脂质体复合物 (V)。

4.11.培养 16-24 小时。

4.12.吸取 RoosterGEM + mRNA 脂质体复合物，替换为 RoosterNourish-MSC-XF，0.4ml/孔。请勿冲洗微

孔。

4.13.密切观察 mRNA 表达情况[一般时间为 1-2 天]

5.细胞收获

5.1.将容器转移到生物安全柜中，并移除旧的培养基。

5.2.向 24 孔板的每个孔中加入 250µL TrypLE 酶。

5.3.将 TrypLE 酶均匀分布以覆盖所有细胞，并将培养瓶置于 37℃培养箱中。每 5min 检查一次培养物，

直至细胞从表面解离出来。轻轻敲击，使剩余细胞从表面脱落。

5.4.向各培养瓶中加入等体积的 RoosterNourish™-MSC-XF，以终止 TrypLE 酶活性。

5.5.将细胞悬液转移至适当的离心管中。

5.6.以 250xg 离心 10min。

5.7.吸出上清液，并使用培养基重悬细胞，以达到所需的细胞浓度。测量细胞悬液的总体积。

5.8.混匀，将 0.5ml 细胞转移至微量离心管中进行细胞计数。

5.9.使用细胞计数仪进行细胞计数，如果计数仪对样品浓度有要求，可根据要求进行稀释。

5.10.细胞已准备好可供使用。

用户注意事项：RoosterBio 产品含有人源性材料，应视为具有潜在传染性。处理时采用通用安全预防措施

并穿戴防护服和护目镜。根据 CDC 生物危害材料指南，采用适当的处置技术。

按照卖方标准条款和条件提供卖方产品。就任何卖方产品的任何使用或应用提供的任何技术建议或建议被

视为可靠，但卖方未就其准确性或完整性或待获得的结果做出任何明示或默示保证。买方全权负责对卖方

产品的质量控制、测试以及确定其适用于预期用途或用途的适用性。

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