吉 林 农 业 大 学 学 报

第 46 卷 第 1 期 2024 年 2 月

期刊基本参数：CN 22-1100/S * 1979 * b * A4 * 174 * zh * P *￥30. 00 * 500 * 23 * 2024-02

特约稿

生物育种在玉米逆境胁迫中的研究进展 ……关淑艳，姜青平，韩利圆，魏小童，焦鹏，刘思言，马义勇（1）

研究论文

Bt水稻杂交后代中外源基因的遗传表达及抗性 ……………………宋子叶，林秀峰，严一字，金永梅（10）

大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选

……………………………………………王蕊，胡绍旺，刘金凤，张毓哲，姜玉石，刘思言，史安迪（17）

紫萼玉簪花提取物对小菜蛾的杀虫活性测定及其成分分析

…………………………………………………王艺卉，毕增一，陈思妤，韩东昊，黄钰麟，袁海滨（28）

玉米茎腐病病原菌Fusarium graminearum拮抗真菌的筛选与鉴定

…………………………………………………………赵子健，王瑶，张逸凡，邓颖，张丹，王晓梅（34）

解淀粉芽孢杆菌AW3诱导发病红松的抗病机制 …………………………………张平，刁健，王立海（40）

棘孢木霉Myb27转录因子基因特性分析、原核表达及产物纯化

…………………………………………………………………韩静，安一博，季世达，田桢，刘志华（49）

山兰原球茎途径种苗快繁技术 ……………………………………………张正海，张亚玉，孙海，张悦（58）

猴头菇多肽的制备及体外抗氧化、降血脂活性 ……………同政泉，刘婷婷，张闪闪，徐新乐，王大为（64）

罗汉果根的生物活性及化学成分 …………………扈芷怡，卢凤来，赵立春，颜小婕，徐祥林，李典鹏（72）

西洋参氧化鲨烯环化酶基因家族的鉴定、组织表达特异性分析及PqOSC2基因的克隆

……………………………………………………………………………………邸鹏，闫艳，王英平（78）

红参水提物对秀丽隐杆线虫寿命的影响……………………………………………张娇，侯微，王英平（86）

不同参膜下人参叶片光合相关参数和产量的差异分析

………………………………………方平，杨鹤，佐月，王轶晗，卫宝瑞，张誉荠，巩金壮，许永华（92）

不同盆栽人参土壤酚酸含量及酶活性变化

…………………………………………战宇，张连学，孟祥茹，王恩鹏，王欢，唐敏，李琼，陈长宝（98）

长期微区试验模拟不同土地利用方式对黑土有机碳与腐殖质组成的影响………………金俍，窦森（107）

玉米秸秆添加对不同母质黑钙土有机碳含量及团聚体稳定性的影响

………………………………………………………郭策，高雪莹，王鸿斌，隋标，赵兰坡，赵兴敏（114）

乙硫氮对鸡粪堆肥理化性质及铜锌钝化效果的影响

……………………………………………………朱延邈，李明刚，成卫民，王玉军，马秀兰，韩兴（123）

吉林省红旗岭镍矿区重金属赋存形态及生物有效性分析………………黄帆，赵兴敏，李明堂，焦帅（131）

UC法和exoEasy法提取鹿茸间充质干细胞外泌体的比较

……………………………………………张琦，杨春，孙胜楠，郭佳，路洪涛，刘莹，杨敏，彭英华（140）

小槐花提取物对甲型H1N1流感病毒感染的体外抑制作用

………………………………………………………徐国双，金新，郭艺迪，张茂林，段铭，关振宏（148）

马铃薯液泡蔗糖转化酶原核表达及多克隆抗血清的制备……………巩慧玲，吕鹏，刘金宝，梁金永（155）

能量补充剂对酮病奶牛肝脏代谢和肝损伤的影响

　　……………………………………………………李伟，房志愿，陈喜莹，杜希良，刘国文，李心慰（161）

用于冬季温室的集热器优化设计 ………………………………李亚楠，陈丽梅，乔凯，高茹，朱永超（168）

吉林省科学技术进步奖一等奖　动物结核病和布鲁氏菌病综合防控关键技术研发与示范应用

………………………………………………………………………………………………（封二，封三）

目 次

（本期执行编辑：王希）

JOURNAL OF JILIN AGRICULTURAL UNIVERSITY

Vol.46 No.1 February 2024

Invited Paper

Research Advances in Biological Breeding under Maize Adversity Stress

………………………GUAN Shuyan，JIANG Qingping，HAN Liyuan，WEI Xiaotong，JIAO Peng，LIU Siyan，MA Yiyong（1）

Research Paper

Genetic Expression and Resistance Evaluation of Foreign Genes in Hybrid Lines of Bt Rice

…………………………………………………………………………SONG Ziye，LIN Xiufeng，YAN Yizi，JIN Yongmei（10）

Screening of Reference Genes Under Abiotic Stress and Different Development Stages of Soybean by Real-Time Fluorescence

　　Quantitative PCR …………WANG Rui，HU Shaowang，LIU Jinfeng，ZHANG Yuzhe，JIANG Yushi，LIU Siyan，SHI Andi（17）

Determination of Insecticidal Activity of Hosta ventricosa Flowers Extracts against Plutella xylostella and Analysis of

　　Their Chemical Components ………WANG Yihui，BI Zengyi，CHEN Siyu，HAN Donghao，HUANG Yulin，YUAN Haibin（28）

Screening and Identification of Antagonistic Fungi against Fusarium graminearum， a Pathogen of Corn Stalk Rot

……………………………………ZHAO Zijian，WANG Yao，ZHANG Yifan，DENG Ying，ZHANG Dan，WANG Xiaomei（34）

Disease Resistance Mechanism of Pinus koraiensis Induced by Bacillus amyloliquefaciens AW3

…………………………………………………………………………………ZHANG Ping，DIAO Jian，WANG Lihai（40）

Characteristics Analysis， Prokaryotic Expression and Product Purification of Trichoderma asperellum Myb27

　　Transcription Factor ……………………………………………HAN Jing，AN Yibo，JI Shida，TIAN Zhen，LIU Zhihua（49）

Rapid Propagation Technology of Seedlings from Protocorm of Oreorchispatens （Lindl.） Lindl.

…………………………………………………………………ZHANG Zhenghai，ZHANG Yayu，SUN Hai，ZHANG Yue（58）

Preparation of Hericium erinaceus Polypeptide and Its Antioxidation and Hypolipidemic Activities in Vitro

…………………………………………TONG Zhengquan，LIU Tingting，ZHANG Shanshan，XU Xinle，WANG Dawei（64）

Chemical Constituents from the Root of Siraitia grosvenorii and Their Biological Activities

…………………………………………HU Zhiyi，LU Fenglai，ZHAO Lichun，YAN Xiaojie，XU Xianglin，LI Dianpeng（72）

Identification and Tissue-specific Expression Analysis of Oxidosqualene Cyclase Gene Family and Cloning of

　　PqOSC2 Gene in Panax quinquefolium ……………………………………………DI Peng，YAN Yan，WANG Yingping（78）

Effect of Red Ginseng Water Extract on Senescence Index of Caenorhabditis elegans

…………………………………………………………………………………ZHANG Jiao，HOU Wei，WANG Yingping（86）

Differences of Photosynthetic Related Parameters and Yield of Ginseng Leaves under Different Ginseng Films

……………FANG Ping，YANG He，ZUO Yue，WANG Yihan，WEI Baorui，ZHANG Yuqi，GONG Jinzhuang，XU Yonghua（92）

Changes of Phenolic Acid Content and Enzyme Activity in Different Potted Ginseng Soils

……ZHAN Yu，ZHANG Lianxue，MENG Xiangru，WANG Enpeng，WANG Huan，TANG Min，LI Qiong，CHEN Changbao（98）

Effects of Long-term Micro-area Experimental Simulation of Different Land Use Patterns on Composition of

　　Organic Carbon and Humus in Black Soil …………………………………………………………JIN Liang，DOU Sen（107）

Effects of Maize Straw Incorporation on Content of Organic Carbon and Stability of Aggregates in Chernozem Derived

　　from Different Parent Materials ……GUO Ce，GAO Xueying，WANG Hongbin，SUI Biao，ZHAO Lanpo，ZHAO Xingmin（114）

Effects of Ethyl Sulfide Nitrogen on Physicochemical Properties and Copper and Zinc Passivation Effect of

　　Chicken Manure Compost ………ZHU Yanmiao，LI Minggang，CHENG Weimin，WANG Yujun，MA Xiulan，HAN Xing（123）

Geometrical States and Bioavailability of Heavy Metals in Hongqiling Nickel Mining Area， Jilin Province

………………………………………………………………HUANG Fan，ZHAO Xingmin，LI Mingtang，JIAO Shuai（131）

Comparison between UC Method and ExoEasy Method for Extracting Exosomes from Antler Mesenchymal Stem Cells

………………ZHANG Qi，YANG Chun，SUN Shengnan，GUO Jia，LU Hongtao，LIU Ying，YANG Min，PENG Yinghua（140）

Inhibitory Effects of Desmodium Caudatum Extracts on H1N1 Influenza A Virus Infection in Vitro

…………………………………XU Guoshuang，JIN Xin，GUO Yidi，ZHANG Maolin，DUAN Ming，GUAN Zhenhong（148）

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antisera Preparation of Vacuolar Invertase in Potato

…………………………………………………………………GONG Huiling，LÜ Peng，LIU Jinbao，LIANG Jinyong（155）

Effects of Energy Supplement on Hepatic Metabolism and Injury of Perinatal Dairy Cows

……………………………………………LI Wei，FANG Zhiyuan，CHEN Xiying，DU Xiliang，LIU Guowen，LI Xinwei（161）

Optimization Design of Heat Collector for Greenhouse in Winter

…………………………………………………………LI Ya'nan，CHEN Limei，QIAO Kai，GAO Ru，ZHU Yongchao（168）

CONTENTS

(Executive Editor: WANG Xi)

吉林农业大学学报 2024，46（1）：1-9 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

生物育种在玉米逆境胁迫中的研究进展*

关淑艳1

，姜青平2

，韩利圆2

，魏小童1

，焦 鹏1

，刘思言1

，马义勇1**

1. 吉林农业大学农学院，长春130118；2. 吉林农业大学生命科学学院，长春130118

摘 要：玉米（Zea mays L.）是重要的粮食作物和饲料作物，不同生长阶段逆境会影响玉米植株的生长，从而

对玉米产量产生负面影响。从育种选择到应用生物技术手段方面提高植物对逆境胁迫的适应能力，可以增加

农作物产量、保护生态系统的稳定性，并为全球粮食安全做出贡献。对玉米育种的发展历程及生物育种中不

同育种技术的优缺点进行概述，论述了生物育种在生物与非生物胁迫等逆境情况下的研究进展，同时以多学

科交叉技术的整合为特征，将育种技术与信息技术相结合，展望了未来育种的发展方向和策略及生物育种在

解决全球粮食安全方面所起的重要作用，以期为育种技术的革新提供有意义的帮助。

关键词：生物育种；玉米；逆境胁迫

中图分类号：S513. 034 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0001-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2023.1801

引用格式：关淑艳，姜青平，韩利圆，等.生物育种在玉米逆境胁迫中的研究进展［J］.吉林农业大学学报，2024，

46（1）：1-9.

Research Advances in Biological Breeding under Maize Adversity

Stress *

GUAN Shuyan1

，JIANG Qingping2

，HAN Liyuan2

，WEI Xiaotong1

，JIAO Peng1

，LIU Si⁃

yan1

，MA Yiyong1**

1. College of Agronomy， Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2. College of Life

Sciences， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China

Abstract：Maize (Zea mays L.) is an important food crop and feed crop. Adversity will affect the dif‐

ferent growth stages of maize plants, which will have a negative impact on maize yield. From breed‐

ing selection to the application of biotechnology to enhance the adaptability of plants to stress, can in‐

creasing crop yield, protecting the stability of the ecosystem, and contributing to global food security,

this paper provides an overview of the development process of maize breeding and the advantages and

disadvantages of various breeding techniques in biological breeding, discusses the research advances

in biological breeding under biological and abiotic stress and other research progress. At the same

time, characterized by the integration of interdisciplinary technologies, breeding technology is com‐

bined with information technology, and the development direction and strategy of future breeding and

the important role of biological breeding in solving global food security are analyzed, in order to pro‐

vide meaningful assistance for the innovation of breeding technology.

Key words：biological breeding； maize； adversity stress

* 基金项目：吉林省科技发展计划项目（20230508005RC）

作者简介：关淑艳，女，博士，教授，研究方向：作物遗传育种及生物技术；姜青平，男，硕士研究生，研究方向：遗传学。

姜青平与关淑艳同为第一作者。

收稿日期：2022-05-07

** 通信作者：马义勇，E-mail：mayiyong70@126.com

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

随着世界人口不断增长，农业生产面临与日

俱增的压力与全新的挑战。近年来，生物胁迫和

非生物胁迫给农业生产力造成了沉重的损失［1-2］

。

而生物育种技术随着时代的进步不断更新迭代，

利用生物技术加快优良性状的培育和提高品种适

应逆境的能力具有重要的应用价值［3］

。面对生物

胁迫和非生物胁迫的挑战，育种技术逐步从传统

育种转变为生物育种，将传统育种与生物技术有

机结合，能够解决农业生产中的“卡脖子”技术问

题，保障国家的粮食安全。在生物育种中，主要是

利用基因克隆所介导的过表达或敲除（RNAi、

VIGS、基因编辑）等手段来培育具有优异农艺性

状和环境适应性的新种质［4-6］

。在全基因组水平

上的高通量基因组学策略主要包括遗传关联作

图、基于图谱的克隆、基因组选择和快速育种等，

在加快作物改良进程中发挥重要作用［7-8］

。本

研究综述了生物育种与高通量测序技术（Nextgeneration sequencing，NGS）相结合在改良玉米抗

逆能力、挖掘响应逆境胁迫相关基因和对应成果

的研究进展，为抗逆新品种的培育提供参考。

1　玉米生物育种研究进展

回望玉米育种发展史，玉米育种从 1.0 到 4.0

阶段，从最原始的驯化育种到杂交育种，到现在的

转基因及智能育种［9］

。其中，最具有历史性的代

表就是世界上第 1 株的转基因烟草的诞生，在

1983 年世界上第 1 例转基因植物在美国成功培

植，这是一种含有抗生素药类抗体的烟草［10］

。随

着转基因技术的问世，人类开始走向了转基因育

种。转基因（Genetically modified，GM）育种可以

在常规育种的基础上加速作物选育的进程，从而

解决全球粮食安全问题。转基因技术也对全球经

济产生了巨大影响，从 1983年世界上第 1株转基

因烟草的诞生到 2012 年的 CRISPR-Cas9 技术问

世，共创造了约 2 000亿美元的利润，其经济影响

使得该技术在未来具有巨大潜力［11-15］

（图1）。

现代生物育种依托育种4.0时代的先进技术，

既包含育种3.0时代的转基因育种，还包括具有代

表性的新一代技术，如 NGS 技术与基因编辑技

术，这些创新技术已经取得重要成果，并迅速在农

业领域得到了应用［16-18］

。生物育种技术中的单倍

体育种、诱变育种、转基因育种和基因编辑等技术

已经普及，但在生产应用中均存在不同的优缺

点（表1）［19-22］

。

1. 1　单倍体育种

玉米是利用杂种优势的农作物品种，玉米杂

交种的应用显著提高了全球玉米总产量。育种纯

系是杂种优势利用的最重要部分［23］

。双单倍体

（Doubled haploid，DH）育种技术是在育种纯系中

新兴的方法，与传统的循环自交方法相比，它可以

显著加快作物育种过程。与分子育种和转基因技

术相似，玉米 DH 育种在商业育种中发挥着越来

越重要的作用，并已成为现代玉米育种的核心技

术之一［24］

。

1. 2　诱变育种

诱变育种是一种重要的育种方法，通过诱导

植物基因组中的随机突变，产生新的性状和变异。

这种方法可以创造出丰富的遗传多样性，加快育

种进程并探索植物的遗传资源。

诱变育种的优势之一是其多样性创造能力。

通过诱发基因组的突变，可以引入大量的遗传变

异，为育种提供更多的选择和可能性。这种多样

性可以帮助育种人员寻找具有所需性状的变异

体，推动作物品种的改良［25］

。此外，诱变育种也

非常高效，相对于自然突变或遗传杂交方法，诱变

育种能够在较短的时间内获得更多的变异体。这

使得育种人员可以更快地筛选出具有所需性状的

植株，加快新品种的培育速度［26］

。

图1　在生物育种中重大成就的时间节点

Fig. 1 Time nodes for significant achievements in biological breeding

2

关淑艳，等：生物育种在玉米逆境胁迫中的研究进展

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

诱变育种还具有探索新基因组组合的能力，

突变体可能具有新的基因组组合，导致新的性状

和表型变化。这为发现和利用植物的潜在遗传资

源提供了机会，可能有助于培育更适应特定环境

或具有更高产量和优质特征的作物品种。

1. 3　转基因育种

转基因育种是一种科学技术，旨在根据培育

目标，通过从供体生物中分离所需基因，并进行

DNA 重组、遗传转化或直接导入受体作物中，通

过筛选获得稳定表达的转基因体，最终通过田间

试验和大规模选择育成转基因新品种或种质资

源。在玉米领域，转基因育种已经取得了显著的

进展［27-28］，如转基因抗虫耐除草剂玉米自交系

LG11的获得及抗性分析，转海藻糖合成酶基因玉

米株系的选育及抗旱性机理研究。

抗虫性和抗草害是玉米转基因育种的主要目

标之一。通过导入产生杀虫蛋白的基因，转基因

玉米可以对特定害虫表现出更强的抵抗力，减少

对农药的依赖。这不仅有助于降低农药使用量，

还能减少害虫对作物的损害，提高产量［29］

。此

外，转基因育种还可以提高玉米的耐逆性。通过

导入耐盐、耐旱或耐寒等基因，转基因玉米可以在

逆境环境下表现出更好的生长和生存能力，特别

是在面临气候变化和不利环境条件的情况下，这

有助于改善作物的稳产和适应性［30］

。

提高玉米的产量和品质也是转基因育种的重

要目标之一。通过导入相关基因，如调控光合作

用的基因或调控子粒大小的基因，转基因玉米可

以实现更高的产量和更好的品质特征［30］

。这对

于满足不断增长的粮食需求和提高玉米的经济价

值具有重要意义［31］

。

1. 4 CRISPR/Cas9 用于植物基因组定点编辑

及作物分子育种

CRISPR/Cas9技术是一种革命性的基因编辑

技术，被广泛应用于植物基因组定点编辑和作物

分子育种。该技术具有高度精准的基因组编辑能

力，可以实现对目标基因的精确修改，这为作物育

种带来了许多潜在的好处。Li 等［32］

在其研究中

第1次将CRISPR/Cas9技术应用于拟南芥和烟草

原生质体，证明了 CRISPR/Cas9 技术在植物领域

中具有高效、简便和特异性强等特点，并为实现植

物中的高精度基因编辑开辟了新的途径。与锌指

核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶

（TALENs）相比，CRISPR/Cas9 具有许多优点，包

括更易于设计和实施、更高的靶向效率和更便宜

的成本。因此，它正在成为敲除单个基因以及插

入 1 个基因和/或控制基因转录的最强大工具

之一。

首先，CRISPR/Cas9 技术可以帮助改良作物

的农艺性状。通过编辑特定的基因可以增强作物

的 抗 病 性 和 抗 逆 性 等 重 要 性 状［33-35］。 其 次 ，

CRISPR/Cas9技术有助于改善作物的品质和营养

价值。通过精确编辑相关基因，可以调控作物的

味道、口感、色泽和营养含量，从而提高作物的市

场竞争力和食用价值［36-37］

。此外，CRISPR/Cas9

技术还可以用于作物的基因功能研究。通过编辑

表1 生物育种中常用育种技术的优缺点

Table 1 Advantages and disadvantages of common techniques involved in biological breeding

育种技术

单倍体育种

诱变育种

转基因育种

基因编辑育种

优点

1.提高变异频率，加快育种过程；

2.大幅度改良部分性状，变异范围广；

3.缩短育种年限，提高选育效果

1.能够在短时间内提高突变率；

2.可获得更优异的表型突变

1.降低生产成本，提高作物产量；

2.打破物种界限，培育出新物种；

3.可增强作物抗病虫害和逆境胁迫的抗性

1.载体设计简易；

2.操作简便；

3.覆盖大多数区域；

4.成本低

缺点

1.不能完全控制诱变的方向和性状；

2.改良数量性状效果不如人意；

3.一般植株弱小，技术复杂；

4.需要和杂交育种相互交叉配合

1.难以控制诱导突变的方向；

2.突变体难以集中多种理想性状

1.长期种植可能会对生态环境产生未知影响；

2.食品物理结构发生改变

1.脱靶问题；

2.外源基因残留问题

3

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

目标基因，研究人员可以了解该基因在植物生长

发育、代谢调控和逆境响应中的作用机制，为深入

理解植物生物学提供重要的工具［38-41］

。

综上，CRISPR/Cas9 技术为植物基因组的定

点编辑和作物分子育种提供了一种强大的工具。

通过精确编辑目标基因，可以改善作物的性状、品

质和营养价值，为农业的可持续发展和粮食安全

做出贡献。

2　生物育种在玉米生物胁迫中的研究进展

植物病害严重影响着作物的生长和产量，仅

植物病害导致的粮食和经济作物减产量高达

20%，直接影响农作物的生产力［42］

。病虫害往往

是相伴相生，昆虫在啃食植株的同时会导致玉米

子粒发生霉病，从而影响玉米的产量与品质。由

于多年的连作和生育期较长等问题，导致了玉米

在病虫害方面防治较为困难，在不喷施农药的情

况下，提升玉米自身抗性是解决玉米病虫害的最

有效和最环保的方法。多年来，常规育种一直是

培育抗逆玉米新品种的主要手段。然而，由于抗

病和抗虫农艺性状是数量性状，导致常规育种选

择合适的基因型来应对病虫害时间相对较长。因

此，生物育种已被广泛地应用于开发抗病与抗虫

玉米新品种（图2）。

2. 1　生物育种在玉米抗病中的应用

截至目前，在商品玉米生产中使用的多数自

交系在抗病方面都很不理想。众所周知，传统的

抗病品种选育主要依赖于育种者的表型选择经

验，这是一个耗时、低效的过程，并且高度依赖于

环境条件。因此，生物育种在抗病育种中展示独

有的魅力，可以迅速通过生物技术来验证基因功

能获得相应抗性的转基因植株，打破传统育种无

法及时满足育种者对高产高品质且抗病需求的育

种瓶颈，为抗病玉米品种奠定基础。Xu等［43］

从玉

米中分离出 1 个新的 NBS 基因 ZmNBS42，通过研

究发现，在 ZmNBS42-OE 拟南芥中比野生型拟南

芥产生更多的水杨酸（SA），从而促进过表达拟南

芥植株对丁香假单胞菌番茄致病变种 DC3000

（Pst DC3000）表现出更强的抗性。这些结果表

明，ZmNBS42 可以作为抗病性的重要调节因子，

有利于增强玉米育种的抗病性。Ye 等［44］

在玉米

抗病基因座（qRfg2）中克隆 ZmAuxRP1，是一类生

长素调节蛋白。在面对病原体胁迫时 ZmAuxRP1

可以迅速而短暂地表达，从而减少病原体感染的

程度。同时 ZmAuxRP1 可以促进吲哚-3-乙酸

（IAA）的生物合成，也抑制了苯并恶嗪类防御化

合物的形成，从而优化植物的适应性。王汉宁［45］

构建了Ubiqutin启动子驱动的含广谱抗真菌基因

和抗除草剂基因的三价植物表达载体 pBIb-CG，

同时建立了骨干自交系茎尖遗传转化体系，通过

该转化体系获得优良自交系“郑58”“昌7-2”除草

剂抗性转基因植株，为玉米转基因育种提供了优

异的玉米种质基础。

2. 2　生物育种在玉米抗虫中的应用

虫害对玉米产量的影响巨大，其中玉米螟和

黏虫的危害最为严重。为了防治玉米螟和其他虫

害，通常在田间管理中使用化学药品。然而，这种

方法不仅对环境产生不利影响，还刺激了害虫不

断变异，产生耐药性，导致抗虫效果逐年减弱。因

此，提升玉米自身对害虫的抗性已经成为抗虫研

究的新趋势［46］

。

植物本身存在针对虫害的防御物质，通过生

物育种可促进防御物质的产生而增加植物的防御

水平，在逆境胁迫中产生重要作用。茉莉酸甲酯

（MeJA）是具有代表性的防御物质，林东江等［47］

通

过对喷施MeJA的玉米进行qRT-PCR调查，对MeJA

的合成通路相关基因进行定量分析，发现外源

MeJA 胁迫下，ZmLox 基因的表达量变化较大，推

测该基因可能是茉莉酸信号通路中的关键基因。

食用喷施 MeJA 叶片对黏虫的影响主要表现为体

重和蛹重减轻，羽化率降低，增加化蛹期时间等，

通过以上方式来提高玉米对黏虫的抗性，而且发

现在喷施MeJA 24 h后，ZmLox基因的显著表达可

能导致玉米叶片中的二氢茉莉酸（H2JA）含量显

著增加，是玉米抗黏虫的重要机制。不仅植物本

身存在抗虫物质，还发现苏云金芽孢杆菌（BT）

在形成过程中可以产生杀虫蛋白晶体，对鳞翅

目、鞘翅目等具有特异毒性，尤其Cry系列被广泛

使用［48］

。李望舒等［49］

将 mCry1AbVip3A 纯化后的

蛋白饲喂玉米螟，发现对一二龄幼虫的致死率为

100%。 通 过 构 建 植 物 过 表 达 载 体 pTF101.1-

mCry1AbVip3A 进行玉米遗传转化并获得转基因

植株，为转基因抗亚洲玉米螟和草地贪夜蛾玉米

育种提供了新材料。李梦桃等［50］

将 cry2Ah-vp 转

入玉米中，发现其蛋白在灌浆期叶片和抽雄期花

4

关淑艳，等：生物育种在玉米逆境胁迫中的研究进展

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

丝中表达量较高，转基因植株在接虫 3 d后，幼虫

死亡率达到100%，表明转基因玉米VP1-5可作为

玉米抗虫育种和害虫防治的种质资源。在育种专

家不断的努力和国家政策的支持下，转基因抗虫

玉米的研发工作取得了巨大进展，已创制出多个

抗虫、耐除草剂的玉米新种质。刘相国［51］

完成了

双向启动子在抗虫、抗除草剂多价转基因玉米新

种质创制，采用抗虫蛋白 CryNGc、抗草甘膦蛋白

EPSPS 和 CaMV35S，驱动草铵膦 PAT 蛋白的新型

植物表达载体，转入到不同玉米受体中，获得“吉

抗 T1P17”“吉抗 9I93”“吉抗 9I97”3 份转基因玉

米新种质，具有抗亚洲玉米螟、抗除草剂草铵膦、

抗除草剂草甘膦的农艺特点。目前，已经有多个

抗虫、耐除草剂的转化体获得安全证书，其中包

括瑞丰125、DBN9936、DBN9858［52-53］

。

3　生物育种在玉米非生物胁迫中的研究

进展

玉米的非生物胁迫主要包括：干旱、冷害、盐

碱、倒伏等，每年因各种不良环境因素而造成玉米

大规模减产。因此，增强玉米抵抗非生物胁迫的

能力至关重要［54］

。但是，传统育种很难准确地根

据抗逆相关的表型性状选育新品种，所以利用生

物育种通过诱变育种的方式或引入外源基因和过

表达植物本身内源基因来增强植物抗性（图2）。

3. 1　生物育种在玉米耐旱中的应用

玉米是对干旱胁迫高度敏感的作物。植物的

抗旱性相当复杂，通过单一抗性基因来提高作物

的抗旱性并不理想。转录因子通过独立调控其下

游靶基因的基因表达水平或与其他转录因子相互

作用，参与植物生长发育、形态发生和各种环境胁

迫响应的调控，从而实现作物对多种胁迫的综合

抗性。玉米耐旱性是一个复杂而综合的数量性

状，其形成机制极其复杂。因此，深入了解玉米的

抗旱性，将有助于调控玉米抗旱性的关键调控因

子。Mao等［55］

对玉米中 NAC 基因进行了分类，其

中 51 个 NAC 基因含有 cis-NATs。ZmNAC48 和

cis-NATZmNAC48 共定位于同一细胞核，2 个基

因均响应干旱胁迫。过表达 ZmNAC48 的拟南

芥植物具有更高的耐旱性、更低的失水率、更强

气孔闭合程度和更高的成活率。而过表达 cisNATZmNAC48 的玉米表现出更高的失水率、较大

的气孔开口和较高的叶片萎蔫程度。上述研究表

明，ZmNAC48 和 cis-NATZmNAC48 都参与植物干

旱胁迫响应，此外，cis-NATZmNAC48可能负调控

ZmNAC48以影响玉米的气孔关闭。Wu等［56］

克隆

了玉米MYB基因ZmMYB3R并对其功能进行了表

征，基因表达分析表明 ZmMYB3R是由干旱、盐和

脱落酸（Abscisic acid，ABA）诱导的，过表达 Zm⁃

MYB3R 的转基因拟南芥植物显示出更强的抗逆

性和更高的存活率，过氧化氢酶（Catalase， CAT）、

过氧化物酶（Peroxidase， POD）和超氧化物歧化酶

（Superoxide dismutase， SOD）等活性增加，对 ABA

的敏感性增加以及对气孔孔径的调节，这表明

ZmMYB3R通过 ABA依赖性途径增强对干旱和盐

胁 迫 的 耐 受 性 。 Wang 等［57］从 玉 米 中 鉴 定 了

WRKY 转录因子基因 ZmWRKY40，位于叶肉原生

质体的核中。ZmWRKY40 的启动子区域中存在

几个与逆境胁迫有关的转录调控元件，同时 Zm⁃

WRKY40也被鉴定到响应干旱、高盐、高温和脱落

酸胁迫。ZmWRKY40 的过表达通过调节胁迫相

关基因提高了转基因拟南芥的耐旱性，并且通过

增强干旱胁迫下的 POD、CAT 活性来降低转基因

品系中的活性氧含量，为了解 ZmWRKY40对玉米

非生物胁迫响应的机制提供理论依据。

3. 2　生物育种在玉米耐寒中的应用

玉米起源于热带地区，现已在温带和寒冷地

区推广，这些地区的玉米经常受到早春、高海拔山

区或高纬度温带地区低温的威胁。这种冷胁迫在

萌发和幼苗阶段频发，导致玉米发芽率低、生长迟

缓、代谢紊乱和组织损伤，最终将造成严重的产量

损失［58］。Li 等［59］通过验证 bZIP 转录因子——

bZIP68，发现其为玉米耐寒性的负调节因子，通过

转录组分析显示，bZIP68抑制DREB1转录因子基

因的冷诱导表达，此外 bZIP68启动子中的 358 bp

插入/缺失（Indel-972）多态性对bZIP68在玉米及

其野生祖先类蜀黍之间的差异表达具有显著影

响。因此，这项研究揭示了一种可用于提高玉米

耐寒性的进化顺式调控变体。Zeng 等［58］

证明了

ZmRR1 的自然变异导致玉米自交系之间的耐冷

性差异。关联分析表明，ZmRR1的 InDel-35编码

含有MPK磷酸化残基的蛋白质，与耐寒性密切相

关。ZmMPK8 是耐寒性的负调节因子，在 Ser15

处与 ZmRR1相互作用并使其磷酸化。携带 Ser15

的 ZmRR1 45 bp 区 域 的 缺 失 ，通 过 阻 止 其 被

5

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

ZmMPK8 磷酸化，来抑制其通过 26S 蛋白酶体途

径的降解，而通过转录组分析表明，ZmRR1 正向

调节 ZmDREB1 和纤维素合酶基因的表达以增

强耐寒性，为提高玉米的耐冷性提供了潜在的

遗传资源。Zhou 等［60］论述了玉米耐寒性的分

子、生理、遗传和基因组分析的最新进展，而且

通过 QTL、GWAS 对耐寒性差异很大的各种玉米

基因型和种群进行了转录组学分析，从而发现

了数百个候选寒冷调控基因，还提出了多种遗

传和基因组方法的联合分析的优势，以提高识

别可进一步用于分子育种的冷调控基因的准确

性。同时还讨论了长距离信号在植物耐寒性中的

作用，这些新见解将为玉米耐寒性提供更好的理

论基础。

3. 3　生物育种在玉米耐盐碱中的应用

近年来，我国北方地区等主要玉米产区的耕

地正在遭受严重的盐碱化问题，这是由于极端的

自然条件和人为因素的共同影响，严重制约了玉

米产量的增长。Liu等［61］

发现，ZmBSK1在盐胁迫

反应中起重要作用，同时 ZmBSK1 蛋白可以与

ZmHSP8和ZmGF14-6蛋白结合，而且它们的基因

表达水平可以通过 NaCl 处理在不同的玉米组织

中显著诱导。该研究结果揭示，ZmBSK1 在盐胁

迫响应中的新功能，为提高玉米抗盐性提供了

理论依据。Luo 等［62］

通过全基因组关联分析的

方 法 挖 掘 到 了 ZmCLCg 和 ZmPMP3，通 过 比 较

CRISPR/Cas9突变体及其野生型植物在盐胁迫下

的表型，候选基因 ZmCLCg 和 ZmPMP3 的耐盐功

能得到证实。经过氯化物含量分析显示，Zm⁃

CLCg 在氯化钠胁迫下调节氯化物转运。这些结

果有助于解释耐盐性的遗传变异，并为产生耐盐

玉米品系提供新的基因资源。

3. 4　生物育种在玉米抗倒伏中的应用

气候因素对子粒机械化直收进程的影响是多

方面的，因此需要合理应对气候因素，同时培育具

有良好抗逆性和抗倒伏的植株，可以提高机械化

直收的效率和作物质量，减少损失和风险。Ren

等［63］

发现，NAC 转录因子 ZmNST3 增强了玉米抗

倒伏性和干旱胁迫耐受性，ChIP-Seq和靶基因表

达分析表明，ZmNST3 直接与 Dynamin 相关蛋白

2A（DRP2A）的启动子结合，并激活与次级细胞壁

纤维素生物合成相关的基因，从而可以增强其抗

倒伏性。Sun 等［64］发现，ZmPAL7 和 ZmPAL8 受

ZmmiR528调控，过表达 ZmmiR528的转基因玉米

植株的木质素含量降低，抗渗透性的抗性降低。

相反，在敲除ZmmiR528或者过表达ZmPAL7植株

中显著增加了木质素含量，提高了玉米对倒伏的

抗性。Zhang等［65］

采用图位克隆和关联图谱确定

了stiff1的等位基因，位于玉米茎秆强度的主要数

量性状基因座上，该基因启动子含有27.2 kb的转

座子元件，编码 F-box 结构域蛋白。这种转座元

件的插入抑制了stiff1的转录，导致细胞壁中纤维

图2　玉米抗逆生物育种方式

Fig. 2 Methods for biological breeding of maize resistant to adverse conditions

6

关淑艳，等：生物育种在玉米逆境胁迫中的研究进展

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

素和木质素含量增加，从而提高了茎的强度。此

外，通过 CRISPR/Cas9 系统产生的经过精确编辑

stiff1 的等位基因 Zm00001d036653，导致植株的

茎比未编辑的对照植株更强壮。Zm00001d036653

及其编辑的等位基因的鉴定，为玉米秸秆强度的

有效改良奠定了基础。

4　展 望

吉林省是我国国家粮食安全的战略基地，加

强农业良种技术攻关，培育重大品种，有序推进生

物育种产业化应用，是保障粮食安全的关键。为

了提高玉米品种抗逆性、品质和产量，跨学科的合

作研究在玉米育种领域中变得至关重要，以开发

新的方法来提高玉米的抗逆性（图 2）［66-72］

。利用

转基因、基因编辑等生物育种技术创制转基因玉

米新种质，同时与传统育种技术相结合，改良和创

制玉米新种质，实现有利基因的重组和高度聚合，

选育出高产、早熟、多抗、宜机收、广适性强的玉米

新种质和新品种，这些举措不仅能够提升种业现

代生物育种技术和研发能力，也能为吉林省玉米

的发展做出巨大贡献。

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（责任编辑：王希）

9

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吉林农业大学学报 2024，46（1）：10-16

Journal of Jilin Agricultural University

Bt水稻杂交后代中外源基因的遗传表达及抗性*

宋子叶1，2，3

，林秀峰2，3

，严一字1**，金永梅2，3**

1. 延边大学农学院，延吉 133002；2. 吉林省农业科学院农业生物技术研究所，长春 130118；

3. 吉林省农业生物技术重点实验室，长春130033

摘 要：以吉林省水稻主推品种“吉粳809”为母本，以Bt转基因水稻材料PP-121、PP-123及PP-136为父本进

行杂交，系谱法筛选获得杂交后代材料Yj-276、Yj-231及Yj-288，通过外源基因的遗传表达及抗性研究，评价

杂交后代育种价值。外源基因的遗传分析表明，cry1C和bar在杂交后代中连锁遗传并共分离；酶联免疫吸附

剂（ELISA）分析表明，杂交后代中cry1C蛋白表达量正常，最高可达1. 78 µg/g；抗性鉴定结果表明，杂交后代中

二化螟抗虫性和除草剂Basta 1. 0×10-3

mol/L耐性均>95%；农艺性状分析表明，部分杂交后代综合农艺性状优

于杂交亲本“吉粳809”，此结果为水稻抗虫育种提供新种质资源及理论依据。

关键词：抗虫转基因水稻；杂交后代；基因表达效应；抗性鉴定

中图分类号：S511 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0010-07

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.6101

引用格式：宋子叶，林秀峰，严一字，等 .Bt水稻杂交后代中外源基因的遗传表达及抗性［J］.吉林农业大学学

报，2024，46（1）：10-16.

Genetic Expression and Resistance Evaluation of Foreign Genes in

Hybrid Lines of Bt Rice

SONG Ziye1，2，3

，LIN Xiufeng2，3

，YAN Yizi1**，JIN Yongmei2，3**

1. College of Agricultural Sciences， Yanbian University，Yanji 133002，China；2. Institute of Agricul⁃

tural Biotechnology， Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China；3. Jilin Pro⁃

vincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology，Changchun 130033，China

Abstract：In this study, Bt transgenic rice lines PP-121, PP-123 and PP-136 were crossed with Ji‐

jing 809, the main rice materials in Jilin province. The hybrid lines of Yj-276, Yj-231 and Yj-288

were obtained and the breeding value was evaluated through genetic expression and resistance evalu‐

ation of foreign genes. The results of genetic analysis showed that foreign genes of cry1C and bar

were linked and co-segregated in the hybrid progenies. Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(ELISA) showed that cry1C protein was expressed normally in hybrid lines, up to 1.78 µg/g. Insect

and herbicide resistance evaluation showed that three hybrid lines were highly resistant to striped

stem borers and Basta 1.0 × 10-3

mol/L compared to female parents. Agronomic character analysis

showed that some hybrid progenies had better performance than that of Jijing809. This study pro‐

vides new germplasm resources and a theoretical basis for insect- resistant rice breeding.

Key words：insect-resistant transgenic rice； hybrid line； gene expression effect； resistance evalua‐

tion

* 基金项目：吉林省农业科技创新工程项目（CXGC2017TD009），国家转基因重大项目（2016ZX08001001-001-007）

作者简介：宋子叶，女，在读硕士，研究方向：水稻生物技术育种。

收稿日期：2020-12-10

** 通信作者：严一字，E-mail：yiziyan@ybu.edu.cn；金永梅，E-mail:ymjin0303@163.com

宋子叶，等：Bt水稻杂交后代中外源基因的遗传表达及抗性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

水稻（Oryza sativa L.）是世界主粮作物之一，

1/2 以上人口以水稻为主食［1-3］

。虫害是影响水

稻产量的重要因素之一，长期以来，虫害主要通过

化学农药进行防治，既增加了生产成本又污染了

环境。由于在水稻中很难找到有效的抗虫基因资

源，因此通过转基因技术培育抗虫水稻品种成为

解决水稻虫害问题的有效途径［4-6］

。近 20 年来，

科学家们利用转基因技术将外源抗虫基因导入水

稻，培育出许多具有有益性状的转基因水稻材料，

为性状改良做出了重大贡献［7-12］

。其中应用最广

泛的外源基因为Bt抗虫基因。

Bt 转基因水稻能否应用于生产，取决于导入

的外源基因能否稳定遗传和预期表达。通过杂

交、回交等常规育种技术将转基因水稻中的目的基

因转移到其他同种或近缘种的品种中，从而达到品

种改良的目的［13-15］

。本研究将吉林省农业科学院

生物技术研究所培育的抗虫转基因水稻材料与吉

林省水稻主推品种“吉粳809”杂交，分析外源基因

在杂交后代中的遗传及功能表达效应，以期为抗虫

转基因水稻在水稻育种中的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1. 1　供试材料

杂交母本为吉林省水稻主推品种“吉粳809”，

由吉林省农业科学院水稻研究所提供。杂交父本

为抗虫转基因水稻纯合系，PP-121，PP-123 及

PP-136，由吉林省农业科学院生物技术研究所培

育，该转基因水稻材料具有鳞翅目害虫抗性和除

草剂草铵膦（Basta）耐性，利用农杆菌遗传转化方

法将 Bt 抗虫基因 cry1C 和筛选标记基因 bar 导入

粳稻品种“吉粳88”，经多代筛选而培育出的单拷

贝纯合系。cry1C和 bar基因植物表达载体图1。

1. 2　转基因水稻与常规水稻的杂交及后代筛选

以“吉粳 809”为母本，3个抗虫转基因水稻纯

合系为父本进行杂交，获得F1种子，通过外源基因

cry1C的PCR检测去除F1伪杂种。F1自交获得F2种

子，结合农艺性状，选择除草剂Basta抗性阳性与阴

性分离比最接近孟德尔遗传规律的F2群体，F2至F3

群体均进行cry1C基因和除草剂Basta抗性筛选。

1. 3　共分离分析

利用 F2及 F3代进行共分离分析，表型鉴定采

用 Basta 耐性鉴定，基因型鉴定利用 cry1C 特异性

引物进行PCR鉴定。

1. 3. 1 Basta 耐性鉴定 采用种子萌发试验，分

别取 F2及 F3种子，利用体积分数分别为 75%的乙

醇和0.1%的升汞，分别灭菌1 min和20 min，清水

冲洗3次，置于1/2 MS培养基（10 mg/L Basta）中，

在光照培养室（30 ℃，12 h 光照/12 h 暗）进行萌

发，7 d后确认种子萌发情况。

1. 3. 2 PCR检测 PCR扩增体系：总体系20 µL，

2×Es Taq MasterMix 10 µL （含有 Es Taq DNA Poly

merase，PCR buffer，3 mmol/L MgCl2，400 µmol/L

dNTP Mix，泰州康为世纪生物科技股份有限公

司），引物各 0.6 µL （10 µmol/L），水稻 DNA 1 µL

（100 ng/µL），剩余用ddH2O补足；PCR扩增程序：

94 ℃ 1 min；94 ℃ 10 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，

35 次循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物经 1% 的琼

脂糖凝胶电泳分离后，用 Super GelRedTM（美 国

US Everbright® Inc 公司）核酸染料染色，紫外透

射仪下观察。cry1C 引物序列为 cry1C-F，5′-TT

AGTGTTGGACGTAACTTCTACTG-3′；cry1C-R，

5′-GAATGTTCTAGATGTGAGGTTCTCT-3′。

1. 4 Basta抗性分离筛选及评价

杂交 F2及 F3后代的 Basta 抗性分离筛选方法

同本文“1.3.1”。每个材料播种约60粒种子，重复

3 次，7 d 后统计 Basta 阳性及阴性株数，并计算卡

方值。

水稻苗期 Basta 耐性评价采用室内喷施除草

剂试验，于水稻苗期喷施除草剂 Basta，浓度为

1.0×10-3

mol/L，14 d后调查水稻除草剂耐性，计算

受害率［16］

。

1. 5　杂交后代DNA提取及PCR检测

取水稻幼苗，利用小量 DNA 提取方法提取

DNA，用 cry1C 特异性引物进行 PCR 鉴定。PCR

扩增体系及产物检测方法同本文“1.3.2”。

1. 6　杂交后代Southern blot检测

取 2.0 g 水稻幼苗，采用 CTAB 法提取基因组

图1 Cry1C植物表达载体

Fig. 1 T-DNA region of cry1C plant expression vector

11

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

DNA［17］

，质检后取60 µg基因组DNA，用限制性内

切酶Sac Ⅰ完全消化，乙醇纯化消化产物，0.8%的

琼脂糖凝胶电泳分离DNA，转膜。用DIG-高引物

DNA标记和检测起始试剂盒Ⅰ（美国Roche公司）

标记的 cry1C 探针进行杂交，利用 CSPD 在 X-ray

Film显影。

1. 7 cry1C蛋白表达测定

水稻分蘖期，取水稻叶片，利用基于胶体金免

疫层析法为原理的 cry1C 蛋白免疫层析试纸（武

汉上成生物科技有限公司），定性检测杂交后代中

cry1C蛋白。

采用ELISA 方法测定 cry1C 蛋白含量。提取

亲本及杂交后代的不同生长时期（分蘖期、抽

穗期、灌浆期及黄熟期）及不同器官（叶片、茎、

根及胚乳）总蛋白，利用 QuantiPlate cry1C 试剂盒

（AP007，美国 EnviroLogix 公司）测定 cry1C 蛋白

含量，操作步骤按照说明书进行。使用 BIORAD iMark 酶标测定仪读取吸光值，绘制标准曲

线并计算各样品的蛋白含量，重复 3 次，计算平

均值。

1. 8　杂交后代离体叶片抗虫鉴定

在水稻分蘖期取水稻叶片，剪成 5 cm，置于

铺有滤纸（用质量分数为 1%的苯并咪唑浸湿）的

培养皿里，以达到保鲜效果，每皿放 2 张新鲜叶

片。采集的鳞翅目害虫二化螟卵块实验室孵化

后，带黑头的 1 龄二化螟幼虫接入叶片上。每皿

接10头，黑暗条件下（28 ℃，相对湿度80%）孵育，

于第7天记录二化螟死亡率，重复3次。

1. 9　栽培管理及农艺性状鉴定

亲本及杂交后代材料种植于吉林省农业科学

院转基因水稻试验田，整个生长期进行正常栽培

管理。收获期测定株高、分蘖数、穗长、结实率、单

株产量等主要农艺性状，每个株系测定 5 株，重

复3次。

1. 10　数据处理

利用SPSS 22.0及Excel进行统计分析和作图。

2　结果与分析

2. 1　外源基因纯合的杂交后代筛选及遗传分析

在杂交后代中，对外源基因进行遗传分析。

cry1C基因特异性PCR和除草剂Basta耐性鉴定结

果显示，母本“吉粳809”无扩增条带，而父本cry1C

转基因水稻及杂交后代中均扩增出目的条带

（图 2-A），F2及F3杂交后代群体中Basta耐性植株

数与cry1C基因PCR阳性植株数的吻合率>97.39%

（表 1），说明目的基因 cry1C 和筛选标记基因 bar

在杂交后代中连锁遗传并共分离。

在杂交后代材料中，通过 cry1C 基因的 PCR

鉴定及 bar基因的除草剂耐性分离比筛选外源基

因纯合系。Basta 耐性筛选结果显示，“吉粳 809”

无抗性，而父本及杂交后代具有抗性。在 F2代中

筛选cry1C基因PCR鉴定和Basta耐性分离比均符

合3∶1，在F3代中筛选2个基因不分离株系，最终筛

选出外源基因纯合的 3 个杂交后代材料 Yj-276

（吉粳 809/PP-121）、Yj-231（吉粳 809/PP-123）

和 Yj-288（吉粳 809/PP-136），见表 2。Southern

blot 结果（图 2）显示，母本“吉粳809”无目的条带，

父本和杂交后代中均获得大小一致的单条带，表明

cry1C在杂交后代中仍以单拷贝遗传。以上结果说

明，cry1C和bar基因已整合在杂交后代基因组中，

且分离比符合孟德尔遗传规律，属显性遗传。

2. 2　杂交后代cry1C蛋白表达分析

利用 cry1C 蛋白试纸条及 ELISA 检测亲本及

杂交后代的 cry1C 蛋白含量（图 3-A）。结果显示

cry1C 蛋白在杂交后代中均成功表达。继而对

Yj-276（吉粳 809/PP-121）亲本及杂交后代不同

生育时期、不同器官的 cry1C 蛋白含量进行测定

（图 3-B）。结果显示，杂交后代中的表达量低于

亲本，最高可达1.78 µg/g；叶片中的表达量最高，

胚乳中表达量最少，仅为0.3 µg/g。

表1 杂交后代共分离分析结果

Table 1 Results of co-segregation analysis of hybrid lines

世代

F2

F3

合计

组合数

3

3

6

Basta耐性株数

146

153

299

cry1C阳性株数

144

149

293

吻合率/%

98.63

97.39

97.99

12

宋子叶，等：Bt水稻杂交后代中外源基因的遗传表达及抗性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 3　杂交后代抗虫鉴定及Basta耐性分析

利用室内抗虫鉴定对亲本及杂交后代中目的

基因cry1C表达蛋白进行功能分析，结果表明，接

一龄二化螟幼虫 7 d 后，母本“吉粳 809”叶片明

显被侵食，叶片表面堆积螟虫排泄物，二化螟

幼虫死亡率为（6.67±5.77）%，成活二化螟生长

正常（图 4），而父本抗虫转基因水稻及杂交后

代叶片无明显侵食特征，保持完好，幼虫死亡率为

（96.67±5.77）%~100.00%，说明杂交后代材料高

抗二化螟（图4-B）。

A. PCR结果： M. 100 bp DNA Ladder；NC.空白对照；1~14.杂交后代Yj-276的不同植株。B. Southern杂交：M.分子量标准；

PC.阳性对照（载体质粒DNA）

图2 Cry1C植物表达载体分子检测电泳

Fig. 2 Cry1C plant molecular detection electrophoretogram

表2 F2及F3群体中Basta耐性筛选结果

Table 2 Results of Basta resistance segregation in F2 and F3 populations

世代

F2

F3

组合

PP-121/Yj-276

PP-123/Yj-231

PP-136/Yj-288

PP-121/Yj-276

PP-123/Yj-231

PP-136/Yj-288

检测数

171

153

169

149

164

157

Basta耐性株数

128

115

126

148

164

155

Basta非耐性株数

43

38

43

1

0

2

χ2

值（耐性∶非耐性=3∶1）

0.001 9

0.002 2

0.017 8

不分离

不分离

不分离

注：χ2

0.05（1）=3.84

13

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

利用除草剂 Basta 耐性鉴定对亲本及杂交后

代中标记基因 bar 进行功能分析，结果表明，用

1.0×10-3 mol/L 浓度喷洒叶面 14 d 后，“吉粳 809”

植株全部死亡。而转基因父本及杂交后代未受

害，植株能够正常生长发育，说明杂交后代材料对

1.0×10-3

mol/L Basta具有良好的耐性（图5）。

2. 4　农艺性状分析

对亲本及杂交后代考察了田间农艺性状，包

括株高、穗长、分蘖数、结实率及单株产量（图6）。

株高方面，杂交后代间无显著差异，但与“吉粳

809”相比差异显著；分蘖方面，Yj-276 及 Yj-288

与“吉粳 809”相比无显著差异，Yj-231 显著低于

“吉粳 809”；穗长方面，仅 Yj-276 与“吉粳 809”相

比无显著差异，其他均存在显著差异；结实率方

面，杂交后代与“吉粳 809”相比均无显著差异，但

Yj-276高于“吉粳809”，结实率达97.13%；单株产

量方面，Yj-276显著高于“吉粳809”。

A.cry1C胶体金快速检测试纸条检测结果；B. PP-121与Yj-276在不同生育时期不同器官中cry1C蛋白含量

图3 Cry1C蛋白试纸条检测及ELISA测定

Fig. 3 Cry1C strip detection and ELISA determination

A.接虫后7 d叶片变化情况；B.接虫后7 d二化螟幼虫死亡率

图4　室内抗虫鉴定

Fig. 4 Evaluation of insect resistance indoor

14

宋子叶，等：Bt水稻杂交后代中外源基因的遗传表达及抗性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3　讨 论

本研究从外源基因的遗传及功能表达2个方

面，对抗虫转基因水稻材料与“吉粳 809”的杂交

后代材料进行评价与筛选。由于目的基因 cry1C

和标记基因 bar 在杂交后代中连锁遗传，因此在

共分离分析中采用 cry1C 的基因型和 bar 基因的

表型鉴定，达到减少工作量和加快育种进程的目

的。cry1C和bar基因在杂交后代中遵循孟德尔遗

传规律，与文献［13，18］的研究结果一致。此外，

cry1C 和 bar 蛋白在杂交后代中得到表达，与柳

絮［19］

的研究结果一致。

针对外源基因功能表达分析，首先利用ELISA

方法对抗虫蛋白进行检测，结果表明，cry1C 蛋白

在杂交后代中均成功表达；对蛋白时空表达模式

分析表明，在水稻主要生育时期内 cry1C 蛋白含

量变化趋势为灌浆期>分蘖期>抽穗期，同一生育

期不同器官中的蛋白含量为叶>茎>根，与叶梦

楠［20］，白 建 江 等［21］所 得 结 果 一 致 。 本 研 究 中

cry1C 蛋白含量与于志晶等［9］

和唐微［22］

研究结果

一致，杂交后代的蛋白含量普遍低于转基因亲本，

这可能是由于外源基因的表达受多种因素影响，

如遗传背景、插入位点、表达单元及辅助因子、生

长条件差异等［23］

。尽管如此，杂交后代对二化螟

的抗虫性没有受到影响，在育种材料筛选中，选择

抗虫性高、Bt 蛋白表达量适中的后代材料，可避

免外源蛋白过量表达而导致的对其他农艺性状的

不利影响。叶片蛋白含量与茎秆及根含量差异较

大，可能是由于不同器官的不同组织结构及生理

A. 喷施除草剂幼苗变化；B. 喷施除草剂幼苗受害率

图5　除草剂Basta耐性评价

Fig.5 Evaluation of Basta tolerance

图6　亲本及杂交后代田间农艺性状对比分析

Fig. 6 Field agronomic traits of parents and hybrid progenies

15

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

状态导致，杨宙等［14］

认为，出现这种差异的原因

是茎秆不同于叶片，主要负责物质的运输及水稻

植株的支撑，抗虫蛋白较难在其中积累，形成较高

的浓度，而叶片更适宜蛋白的积累。

在离体叶片抗虫鉴定中，转基因亲本及杂交

后代均表现出高抗虫性，而母本“吉粳 809”则受

到严重虫害，叶脉变色严重且中空，在叶片表面堆

积大量螟虫排泄物，与刘洋等［24］

和刘显波等［25］

室

内抗虫鉴定结果相吻合。此外，苗期Basta耐性评

价结果表明，杂交后代对高浓度 Basta 具有耐性，

说明除草剂耐性基因 bar 在杂交后代中成功表

达，与崔莹［26］

的结果相符。

“吉粳 809”是吉林省主推国审超级稻品种，

具有高产、优质、抗稻瘟病的特点。目前尚无将

Bt抗虫基因导入该品种的报道。本研究获得“吉

粳 809”为背景的抗虫耐除草剂粳稻材料，外源基

因在杂交后代中均稳定遗传且成功表达。部分杂

交后代具备一定育种价值，其田间抗虫性及除草

剂耐性有待于进一步考察。

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（责任编辑：王希）

16

吉林农业大学学报 2024，46（1）：17-27 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定

量PCR内参基因筛选*

王 蕊，胡绍旺，刘金凤，张毓哲，姜玉石，刘思言**，史安迪

吉林农业大学生命科学学院，长春130118

摘 要：为研究大豆在不同发育时期的不同组织、不同非生物胁迫下稳定表达的最适内参基因，以大豆

“JN28”V1时期的根、茎、叶，R3、R4时期的豆荚，R5、R8时期的子粒，干旱、低温、盐、脱落酸（ABA）胁迫下的根

和叶共 15 个样本为试验材料。选择 8 个候选内参基因（Actin，β-actin，CYP2，EF1-α，Fbox，GAPDH，TUB4，

18SrRNA）进行实时荧光定量 PCR 检测，并分析 8 个候选内参基因表达的稳定性。利用 geNorm、NormFinder、

BestKeeper软件分析后，再经过RefFinder计算筛选出合适的内参基因。结果表明：4个软件的分析结果不同，

以 RefFinder综合分析结果显示，V1期的根和叶、R3期的豆荚、ABA 胁迫下的根，最适的内参基因为 Actin；V1

期的茎、R4期的豆荚、R8期的子粒，最适内参基因为EF1-α；R5期的子粒、干旱胁迫下的叶，最适内参基因为

Fbox；干旱胁迫下的根，最适的内参基因为CYP2；盐胁迫的根、ABA胁迫下的叶，最适内参基因为18SrRNA；低

温胁迫下的叶，最适内参基因为β-actin；低温胁迫下的根，最适内参基因为EF1-α和18SrRNA；盐胁迫下的叶，

最适内参基因为β-actin和18SrRNA。4个软件在全部组织及全部胁迫中综合分析结果均一致，在全部组织中

最适内参基因为Actin，全部胁迫中最适内参基因为EF1-α。

关键词：大豆；实时荧光定量PCR；内参基因；非生物胁迫；发育时期

中图分类号：S565. 1 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0017-11

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1219

引用格式：王蕊，胡绍旺，刘金凤，等.大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选［J］.

吉林农业大学学报，2024，46（1）：17-27.

Screening of Reference Genes Under Abiotic Stress and Different

Development Stages of Soybean by Real-Time Fluorescence Quanti⁃

tative PCR *

WANG Rui，HU Shaowang，LIU Jinfeng，ZHANG Yuzhe，JIANG Yushi，LIU Siyan**，

SHI Andi

College of Life Sciences， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China

Abstract：In order to study the optimal reference genes stablely expressed in different tissues and

under different abiotic stresses in different development stages of soybean, 15 soybean samples were

used as experimental materials, including roots and leaves in JN28 V1 stage, pods in R3 and R4

stages, grains in R5 and R8 stages, and roots and leaves under drought and low temperature salt ABA

stress. Eight candidate reference genes (Actin, β -actin, CYP2, EF1- α, Fbox, GAPDH, TUB4,

18SrRNA) were selected for real-time quantitative PCR detection, and the expression stability of the

* 基金项目：国家重点研发计划子课题（2019YFD1002603-1），吉林省自然科学基金项目（20190201168JC），吉林省教育厅科学技

术研究规划项目（2021），吉林农业大学本科生科技创新基金项目（2019，2021）

作者简介：王蕊，女，在读硕士，研究方向：植物基因工程、种质资源创新与分子育种。

收稿日期：2021-04-15

** 通信作者：刘思言，E-mail：siyan_2001@163.com

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

eight candidate reference genes was analyzed. After analysis with the geNorm NormFinder Best‐

Keeper software, the appropriate internal reference genes were selected by RefFinder calculation.The

results showed that the analysis results of the 4 software were not the same. The comprehensive analy‐

sis results of RefFinder showed that the root of stage V1, leaf of stage V1 and root of stage R3 under

ABA stress, the most suitable internal reference gene was Actin.EF1-α was the most suitable refer‐

ence gene for stem of stage V1 and pod of stage R4 and grain of stage R8.In R5 stage, Fbox was the

most suitable reference gene for leaves under drought stress.The optimal reference gene for roots un‐

der drought stress was CYP2. The optimal reference gene for leaves under ABA stress was 18SrRNA.

β-actin was the most suitable reference gene for leaves under low temperature stress.For roots under

low temperature stress, the optimum reference gene were EF1-α and 18SrRNA.In leaves under salt

stress, the most suitable reference genes were β-actin and 18SrRNA.The comprehensive analysis re‐

sults of the 4 software were consistent in all tissues and stresses. The most suitable reference gene

was Actin in all tissues, and the most suitable reference gene was EF1-α in all stresses.

Key words：soybean； real-time quantitative PCR（qRT-PCR）； internal reference gene； abiotic

stress； developmental stage

大豆［Glycine max（L.） Merr.］是我国重要的

粮食作物和经济作物之一，它含有大量的优质蛋

白和不饱和脂肪酸。目前，通过分子生物学方法

研究大豆的相关基因功能，特别是通过转基因技

术来改良大豆的品质是大豆科研的研究热点。

实 时 荧 光 定 量 PCR（Real-time quantitative

PCR， qRT-PCR）具有极高的敏感性、特异性、重

复性和高性价比的特点，是研究基因转录和调控

的最基本方法［1］

。内参基因是一类在不同试验条

件、不同品种、不同胁迫处理、不同组织中均稳定

表达的基因［2］

，可影响目的基因表达量的准确性。

选择合适的内参基因是确保试验准确性的首要因

素。例如，肌动蛋白基因（Actin，ACT）、亲环蛋白

基因（Cyclophilin，CYP）、延伸因子（Elongation fac‐

tor，EF）、微管蛋白（Tublin）、18S核糖体RNA基因

（18SrRNA）等通常作为内参基因出现［3-7］

。但目

前对在不同发育时期和生物或非生物胁迫的条件

下均稳定表达的内参基因的报道较少。因此，在

不同试验中筛选能稳定表达的内参基因对基因的

定量分析具有重要意义。

不同试验条件下大豆内参基因的选择不同。

Jian 等［3］

研究发现，ELF1B 和 CYP2 内参基因在大

豆不同品种、不同光周期、不同发育时期下的组织

器官中能稳定表达；在干旱胁迫条件下，稳定的内

参基因为 TUB4、TUA5 和 EF1A

［8］

；在盐胁迫条件

下，稳定的内参基因为 EF1A 和 ACT11［8］

；氮胁迫

不同品种的大豆，ELF1B 和 ACT11 被鉴定为最稳

定表达的内参基因。在不同病毒和虫害胁迫下的

稳定内参基因也不同，在豆荚斑驳病毒（Bean pod

mottle virus）和大豆蚜虫（Soybean aphid）胁迫下，

ABCT 和 FBOX是大豆最稳定的内参基因［9］

。大豆

在不同品种、不同组织、不同发育时期、不同胁迫条

件下，最稳定的内参基因并不相同。因此，结合不同

的研究方向，对大豆不同品种的不同组织部位、不同

发育时期、不同胁迫下的内参基因进行稳定性的筛

选，可以为后续试验提供依据。

本研究采用实验室保存的大豆品种“吉农28”

（“JN28”）为试验材料，经过查阅文献，选择了8个

候选的内参基因（Actin，β-actin，CYP2，EF1-α，

Fbox，GAPDH，TUB4，18SrRNA），分别以大豆不同

发育时期的不同组织（V1 期的根、茎、叶；R3 期、

R4期、R5期、R8期的 5 mm豆荚、2 cm 豆荚、3 mm

子粒及成熟的子粒）、4 种非生物胁迫［干旱、低

温、盐、脱落酸（ABA）］下的根和叶为样本，分别分

析这些候选内参基因在不同样本中的表达稳定

性，进而整体分析不同组织器官和不同胁迫条件

下稳定的内参基因，为大豆抗逆相关基因功能和

大豆转基因育种研究时稳定内参基因的选择提供

数据支持。

1　材料与方法

1. 1　植物材料

本试验所用大豆品种为“JN28”，由吉林农业

大学玉米及油料作物种质资源创新与分子育种创

18

王蕊，等：大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

新团队实验室保存提供。

1. 2　植物材料的处理

将氯气灭菌12 h后的大豆“JN28”接种于1/10 MS

培养基中，进行萌发。约3 d后移至霍格兰营养液

中，液体培养直至V1期，取其根、茎、三出复叶；将

水培的大豆分别进行干旱胁迫［w（PEG6000）=

10%］、低 温 胁 迫（4 ℃）、盐 胁 迫（100 mmol/L

NaCl）及ABA胁迫（100 µmol/L ABA）的营养液胁

迫处理 0，3，6，12 h，取其根及三出复叶。取土培

的大豆初荚期（R3期，5 mm豆荚）、盛荚期（R4期，

2 cm 豆荚）、鼓粒期（R5 期，3 mm 子粒）及完熟期

（R8期，成熟子粒）。以上所有材料均取 3~4次生

物学重复，存于-80 ℃冰箱中保存备用。

1. 3　总RNA的提取与cDNA合成

将储存样品研磨后，依据植物总RNA提取试

剂盒说明书进行总 RNA 的提取。使用泰州康为

世纪生物科技股份有限公司 HiFiScript gDNA Re‐

moval RT Master Mix 反转录试剂盒，根据说明书

合成第1条链cDNA，于-20 ℃中保存备用。

1. 4　候选内参基因的选择与引物设计及验证

选择8个内参基因Actin，β-actin，CYP2，EF1-

α，Fbox，GAPDH，TUB4，18SrRNA。 利 用 Primer

Premier 5.0 软件设计内参基因引物（表 1），由长

春库美生物科技有限公司合成。通过 PCR 对设

计 的 引 物 扩 增 特 异 性 进 行 验 证 ，反 应 体 系 ：

12.5 µL 2×Es Taq Master Mix（泰州康为世纪生物

科技股份有限公司），0.5 µL（10 mmol/L）引物，

1 µL cDNA，10.5 µL ddH2O。反应程序：94 ℃预变

性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸

30 s，35 次循环；72 ℃后延伸 8 min；4 ℃保存。用

质量分数为 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物

的特异性。

1. 5　候选内参基因的实时荧光定量PCR

实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）使用 96 孔的

Mx3000p（Stratagene）型实时荧光定量系统，采用

GeneCopoeia 广州易锦生物技术有限公司的 Allin-OneTM qPCR Mix 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 试

剂。反应体系：10 µL 2×All-in-OneTM qPCR Mix，

0.4 µL（10 mmol/L）引物，0.1 µL ROX Reference

Dyed（30 µmol/L），2 µL cDNA，7.1 µL RNase-free

去离子水。反应条件：95 ℃预变性 10 min；95 ℃

变性 30 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 15 s，40 次循

环。熔解曲线分析：95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃

30 s。每个样品均设置3次生物学重复，以确保结

果误差小、准确性高。

1. 6　引物扩增效率分析

将已反转录合成的 cDNA采用模板浓度梯度

法，将其以 5 的倍数稀释为 50

，5-1

，5-2

，5-3

，5-4

，共

5 个梯度。分别进行 qRT-PCR 检测，获得每个候

选内参基因在不同模板稀释浓度下的样品循环阈

值（Ct值），绘制出横坐标为 log 的值、纵坐标为 Ct

值的标准曲线，得出斜率（K）及相关系数（R2

），通

过公式E=10-1/K

-1，计算得出8个候选内参基因的

扩增效率。

1. 7　候选内参基因表达稳定性分析

为了筛选适合大豆的内参基因，根据 Ct 值，

利用 3 个常用的软件 geNorm、NormFinder 和 Best‐

Keeper 对数据进行处理［10-12］

，分别得出该程序下

候选内参基因稳定性的排序。再用 RefFinder 对

3 种分析软件所得结果进行综合排序［13］

，综合评

价候选基因的稳定性。

2　结果与分析

2. 1　候选内参基因扩增效率和扩增特异性

通过PCR验证8个内参基因扩增产物的特异

性，扩增产物经过质量分数为 1% 的琼脂糖凝胶

电泳检测，目的条带单一，扩增片段与预期结果一

致，未见非特异性扩增和引物二聚体（图 1）。经

过 qRT-PCR 检测，熔解曲线分析表明，每个内参

基因引物扩增产物对应单个片段，均具有单一信

号峰，无其他非特异性扩增（图2）。

M. DL2000 Marker；1~8. PCR 产 物 依 次 为 Actin，β -actin，CYP2，

EF1-α，Fbox，GAPDH，TUB4，18SrRNA

图1　大豆8个候选内参基因的PCR产物

Fig. 1 PCR products of 8 candidate internal ginseng

genes in soybean

19

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

以 5 倍稀释的 5 个梯度 cDNA 为模板，合成

的 8 个候选内参基因引物进行 qRT-PCR 分析，

根据各个浓度梯度的每个内参基因的 Ct 值，绘

制标准曲线并计算斜率 K，结果见表 1。由表 1

可知，各个标准曲线的相关系数 R2

≥0.992 5，引

物扩增效率（E）为 96.7%~110.0%，说明各个内参

引物扩增效率基本一致。上述结果说明，各个内

参基因的扩增效率及产物特异性符合 qRT-PCR

条件，可以进行内参基因稳定性评价。

图2　大豆8个候选内参基因的qRT-PCR熔解曲线

Fig. 2 qRT-PCR melting curves of 8 candidate internal reference genes in soybean

表1 大豆候选内参基因、引物序列及PCR扩增特性分析

Table 1 Analysis of soybean internal reference gene， primer sequence and PCR amplification characteristics

基因

Actin

β-actin

CYP2

EF1-α

Fbox

GAPDH

TUB4

18SrRNA

基因登录号

NC_016089

XM_026124165

TC224926

NC_038253.1

NC_038248

NC_016091.3

NC_038255.1

X02623

引物序列（5'→3'）

F：GCGGGAAATTGTAAGGGATGT

R：TCGCCAATAGTGATGACCTG

F：CCTTCTCTCTCTCTCCCTCTTT

R：CTCAGTGTCTGCCATCTTCTAC

F：CGGGACCAGTGTGCTTCTTCA

R：CCCCTCCACTACAAAGGCTCG

F：TGCAAAGGAGGCTGCTAACT

R：CAGCATCACCGTTCTTCAAA

F：GAATCGGTGGGAGATTTAGCG

R：CCAAAGAGTGTCATCGGAAGC

F：CCAGTAAGGATGCCCCCATG

R：CAAGGCAGTTGGTTGTGCAG

F：CTCATCCCTTTCCCTCGTCTG

R：TCTTGGCATCCCACATTTGCTG

F：CTACGTCCCTGCCCTTTGTACA

R：ACACTTCACCGGACCATTCAA

扩增长/bp

141

118

154

200

120

102

124

65

扩增效率/%

110.0

101.0

97.8

97.8

101.6

109.4

96.7

103.1

R2

0.997 5

0.999 9

0.999 9

0.999 6

0.999 8

0.995 1

0.999 7

0.992 5

20

王蕊，等：大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 2　候选内参基因在不同发育时期、不同组织

及不同胁迫中的表达量分析

每个样品设置 3 次生物学重复，利用 Ct 值来

估算基因的表达水平，Ct 值与表达丰度成反比，

同一个基因的 Ct 值在不同样品间的变化反映了

表达水平的变异性。通过 SYBR GreenⅠ荧光染

料法对大豆“JN28”的8个候选内参基因进行转录

水平分析，结果见图 3。由图 3 可见，在检测的

15个样品中，8个候选内参基因表现出了较宽范围

的 Ct 值，即 18SrRNA 基因的 Ct 值最小，为 13.67，

GAPDH 基因 Ct 值最大，为 32.52。在不同发育时

期、不同组织及不同胁迫下，所有候选内参基因中

平均表达量最低的为 18SrRNA 基因，平均 Ct值为

16.396；平均表达量最高的为 GAPDH 基因，平均

Ct 值为 30.808。其中 CYP2 基因的 Ct 值为 21.47~

24.37，是 8 个候选内参基因中表达水平变异最小

的；Fbox基因的Ct值为25.41~31.53，是8个候选内

参基因中表达水平变异最大的。以上结果表明，

候选内参基因表达丰度和表达水平变异程度在不

同发育时期、不同组织及不同胁迫中的规律性不

强，需要进一步借助内参分析软件对其进行稳定

性评估。

2. 3　候选内参基因稳定性分析

2. 3. 1 geNorm 软件分析 geNorm 得出的结果：

一个是平均稳定值M，M值越小，证明该内参基因

表达越稳定，反之越不稳定；另一个是最佳配对变

异值 Vn/（n+1），可分析使用多个内参基因时的配对

差异。将候选内参基因的结果经过2－ΔΔCt法计算，

输入程序后，利用 geNorm 软件对 15 个样本进行

分析，结果见图 4。由图 4 可见，大豆“JN28”的

15 个样品的 M 值均<1.5。根、茎、叶、R3、R4、R5、

R8 最稳定的内参基因分别是 β-actin、18SrRNA；

EF1-α、Fbox；CYP2、TUB4；Actin、18SrRNA；TUB4、

18SrRNA；Fbox、18SrRNA；Actin、CYP2。从所有组

织部位分析，表达稳定程度由高至低：Actin =

EF1- α > TUB4 > CYP2 > 18SrRNA > β -actin >

GAPDH> Fbox。干旱胁迫的根（PR）、干旱胁迫的

叶（PL）、低温胁迫的根（LR）、低温胁迫的叶（LL）、

盐胁迫的根（NR）、盐胁迫的叶（NL）、ABA胁迫的

根（AR）、ABA 胁迫的叶（AL）最稳定的内参基因

分别是 EF1-α、CYP2；TUB4、Actin；18SrRNA、Ac⁃

tin；Fbox、β-actin；18SrRNA、CYP2；18SrRNA、β-ac⁃

tin；EF1-α、CYP2；18SrRNA、Fbox。所有胁迫表达

稳定程度由高至低：EF1-α=Actin>TUB4>Fbox>

CYP2>β-actin>18SrRNA>GAPDH。geNorm软件还

可以分析使用多个内参基因时的配对差异，结果

见图 5，在 1 个组织部位或 1 种胁迫条件下 V2/3<

0.15，最适的内参基因数为 2；但分析全部组织部

位和全部胁迫条件下的最适内参基因数分别为

5和4。

2. 3. 2 NormFinder 软件分析 NormFinder 软件

同样通过 2－ΔΔCt法计算，将结果输入程序中，根据

S 值（稳定值）的大小来得出最稳定的内参基因：

S值越小，该内参基因越稳定；反之越不稳定。同

时软件会给出1个最佳的内参基因。通过对大豆

“JN28”的15个样本进行稳定性分析，结果见表2。

Actin是根、叶、R3、AR最稳定的内参基因，EF1-α

是茎、R4、R8、LR、AL 最稳定的内参基因，Fbox 是

R5、PL 最稳定的内参基因，CYP2 是 PR、NL 最稳

定的内参基因；β-actin 是 LL、NR 最稳定的内参

基因，大豆全部组织部位最稳定的内参基因为

Actin，大豆 4 种胁迫下的根和叶中最稳定的内参

基因为EF1-α。

箱体部分为 Ct 值的集中范围，箱体中的×为平均数，箱体中的横

线为中位数，箱体的上下边线分别为上4位数和下4位数，箱体的

上下2个端线分别为数据最大值和最小值

图3 15个样本的8个内参基因的Ct值分布

Fig. 3 Distribution of Ct values of 8 internal reference

genes in 15 samples

21

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

图4 geNorm软件分析15个样本的候选内参基因稳定性表达

Fig. 4 geNorm analysis of stable expression of candidate internal genes in 15 samples

22

王蕊，等：大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 3. 3 BestKeeper 软件分析 BestKeeper 软件

分析内参基因的稳定性，直接输入 Ct 值即可，通

过计算每一个样本各个基因间的配对标准差

（SD）、变异系数（CV）的大小来反映基因的稳定

性。一般用 SD 的数值判别该基因的稳定性，SD

值越小越稳定。当 SD>1 时则该内参基因为不稳

定内参基因。由表2可知，Actin是根、叶、AL最稳

定的内参基因，EF1-α 是 R3、R4、R5 最稳定的内

参基因，18SrRNA 是茎、NR、AR 最稳定的内参基

因，Fbox是R8、PR、NL最稳定的内参基因，β-actin

是 PL、LL 最稳定的内参基因，TUB4 是 LR 最稳定

的内参基因。可见大豆全部组织部位最稳定的内

参基因为 Actin，大豆 4 种胁迫下的根和叶中最稳

定的内参基因为EF1-α。

2. 3. 4 RefFinder 分析 从 3 种软件对 8 个候选

内参基因的分析结果来看，3 种软件的分析结果

不同，说明3种软件的分析方法存在差异。因此，

通过RefFinder对3种软件分析结果的排序进行几

何平均值计算，综合分析 8 个候选内参基因的稳

定性。通过表 2 可以看出，根、叶、R3、AR 最稳定

的内参基因为 Actin，茎、R4、R8 最稳定的内参基

因为 EF1-α，R5、PL 最稳定的内参基因为 Fbox，

PR 最稳定的内参基因为 CYP2，LL 最稳定的内

参基因为 β-actin，NR、AL 最稳定的内参基因为

18SrRNA。低温胁迫下的根，最适内参基因为

EF1-α和18SrRNA；盐胁迫下的叶，最适内参基因

为 β-actin 和 18SrRNA。可见大豆全部组织部位

最稳定的内参基因为 Actin，大豆 4 种胁迫下的根

和叶中最稳定的内参基因为EF1-α。

表2 NormFinder、BestKeeper、RefFinder软件分析候选内参基因的稳定性

Table 2 Stability of candidate internal reference gene analysis by NormFinder， BestKeeper and RefFinder software

根

茎

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

Actin

(0.019 61)

Actin (0)

Actin (1.71)

EF1-α

(0.004 90)

18SrRNA

(0.01)

EF1-α

(1.44)

TUB4

(0.019 62)

TUB4

(0.04)

TUB4 (2.52)

Fbox

(0.004 91)

TUB4 (0.04)

Fbox (2.00)

Fbox

(0.026 96)

Fbox (0.05)

18SrRNA

(2.71)

Actin

(0.004 93)

EF1-α (0.06)

18SrRNA

(3.30)

CYP2

(0.144 65)

18SrRNA

(0.15)

β-actin

(3.11)

β-actin

(0.004 94)

Fbox (0.08)

TUB4 (3.68)

18SrRNA

(0.176 40)

β-actin

(0.16)

Fbox (3.78)

TUB4

(0.015 54)

β-actin

(0.09)

β-actin

(3.91)

β-actin

(0.182 89)

CYP2 (0.19)

EF1-α (5.28)

18SrRNA

(0.062 39)

CYP2 (0.10)

Actin (4.38)

EF1-α

(0.251 61)

EF1-α (0.21)

CYP2 (5.52)

CYP2

(0.205 66)

Actin (0.11)

CYP2 (6.65)

GAPDH

(0.597 88)

GAPDH

(0.57)

GAPDH

(8.00)

GAPDH

(0.434 81)

GAPDH

(0.48)

GAPDH

(8.00)

项目 软件 1 2 3 4 5 6 7 8

图5 geNorm软件分析最佳候选内参基因数目

Fig. 5 Analysis of the optimal number of candidate internal reference genes using geNorm software

23

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

叶

R3

R4

R5

R8

Total

PR

PL

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

Actin

(0.002 45)

Actin (0.01)

Actin (1.59)

Actin

(0.000 05)

EF1-α

(0.03)

Actin (1.59)

EF1-α

(0.017 90)

EF1-α

(0.02)

EF1-α

(1.44)

Fbox

(0.002 45)

EF1-α

(0.04)

Fbox (1.71)

EF1-α

(0.019 61)

Fbox (0)

EF1-α

(2.15)

Actin

(0.172 07)

Actin (0.44)

Actin (1.00)

CYP2

(0.072 00)

Fbox (0.53)

CYP2 (1.44)

Fbox

(0.093 23)

β-actin

(0.53)

Fbox (2.29)

CYP2

(0.004 90)

Fbox (0.02)

CYP2 (2.15)

18SrRNA

(0.000 06)

TUB4 (0.04)

18SrRNA

(2.15)

Actin

(0.0318 6)

TUB4 (0.03)

TUB4 (1.82)

18SrRNA

(0.002 46)

TUB4 (0.08)

18SrRNA

(2.29)

TUB4

(0.019 64)

EF1-α (0.05)

Fbox (2.29)

CYP2

(0.1888 8)

EF1-α (0.46)

EF1-α (2.29)

EF1-α

(0.072 09)

EF1-α (0.63)

EF1-α (1.59)

EF1-α

(0.102 70)

Fbox (0.56)

Actin (2.52)

TUB4

(0.004 91)

EF1-α (0.03)

TUB4 (2.29)

Fbox

(0.014 54)

Fbox (0.06)

EF1-α (2.52)

TUB4

(0.059 89)

Actin (0.04)

18SrRNA

(2.52)

Actin

(0.014 70)

Actin (0.10)

EF1-α (2.71)

Fbox

(0.022 06)

TUB4 (0.09)

Actin (2.71)

TUB4

(0.188 89)

18SrRNA

(0.57)

TUB4 (3.30)

Actin

(0.081 00)

CYP2 (0.64)

Fbox (2.52)

β-actin

(0.105 01)

18SrRNA

(0.72)

β-actin

(2.76)

EF1-α

(0.009 80)

TUB4 (0.04)

EF1-α (3.30)

EF1-α

(0.199 98)

Actin (0.13)

Fbox (3.00)

18SrRNA

(0.067 56)

18SrRNA

(0.05)

Actin (3.30)

CYP2

(0.093 12)

β-actin

(0.11)

Actin (3.00)

18SrRNA

(0.044 11)

Actin (0.13)

CYP2 (3.11)

β-actin

(0.205 06)

TUB4 (0.68)

CYP2 (3.42)

Fbox

(0.231 00)

GAPDH

(0.79)

Actin (3.56)

Actin

(0.171 54)

Actin (0.79)

TUB4 (3.27)

Fbox

(0.036 02)

CYP2 (0.05)

Fbox (3.68)

TUB4

(0.206 91)

18SrRNA

(0.14)

TUB4 (3.68)

CYP2

(0.092 13)

Fbox (0.06)

Fbox (4.93)

EF1-α

(0.220 96)

Fbox (0.13)

TUB4 (3.91)

Actin

(0.263 61)

CYP2 (0.15)

TUB4 (3.30)

Fbox

(0.762 85)

CYP2 (0.74)

18SrRNA

(4.72)

TUB4

(0.584 00)

Actin (0.82)

GAPDH

(5.24)

18SrRNA

(0.233 88)

TUB4 (0.95)

EF1-α (3.63)

β-actin

(0.046 56)

β-actin

(0.15)

β-actin

(6.00)

CYP2

(0.450 23)

CYP2 (0.23)

CYP2 (6.00)

Fbox

(0.095 46)

β-actin

(0.09)

β-actin

(5.94)

TUB4

(0.267 97)

18SrRNA

(0.14)

β-actin

(5.52)

CYP2

(0.285 78)

18SrRNA

(0.18)

β-actin

(5.28)

EF1-α

(0.964 65)

Fbox (1.16)

β-actin

(5.52)

GAPDH

(0.685 00)

TUB4 (1.07)

TUB4 (5.31)

CYP2

(0.315 22)

EF1-α (1.03)

18SrRNA

(4.22)

18SrRNA

(0.412 59)

18SrRNA

(0.29)

18SrRNA

(7.00)

GAPDH

(0.567 89)

GAPDH

(0.71)

GAPDH

(7.00)

β-actin

(0.121 19)

CYP2 (0.13)

CYP2 (6.26)

β-actin

(0.300 24)

CYP2 (0.33)

CYP2 (5.81)

β-actin

(0.342 00)

β-actin

(0.19)

18SrRNA

(5.52)

18SrRNA

(1.890 88)

β-actin

(1.34)

Fbox (6.21)

β-actin

(0.985 00)

β-actin

(1.08)

β-actin

(7.00)

TUB4

(0.343 40)

CYP2 (1.09)

CYP2 (5.01)

GAPDH

(0.803 94)

GAPDH

(0.82)

GAPDH

(8.00)

β-actin

(0.643 51)

β-actin

(0.77)

β-actin

(8.00)

GAPDH

(0.353 21)

GAPDH

(0.35)

GAPDH

(8.00)

GAPDH

(1.002 47)

GAPDH

(1.09)

GAPDH

(8.00)

GAPDH

(1.557 08)

GAPDH

(1.57)

GAPDH

(8.00)

GAPDH

(2.710 45)

GAPDH

(1.38)

GAPDH

(7.65)

18SrRNA

(0.991 00)

18SrRNA

(1.25)

18SrRNA

(8.00)

GAPDH

(1.560 99)

GAPDH

(1.62)

GAPDH

(8.00)

Continued table 2

项目 软件 1 2 3 4 5 6 7 8

续表2

24

王蕊，等：大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

LR

LL

NR

NL

AR

AL

胁迫

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

NormFinder

BestKeeper

RefFinder

EF1-α

(0.067 94)

TUB4 (0.17)

EF1-α

(2.00)

β-actin

(0.056 17)

β-actin

(0.06)

β-actin

(1.00)

β-actin

(0.045 54)

18SrRNA

(0.16)

18SrRNA

(1.44)

CYP2

(0.019 65)

Fbox (0.11)

β-actin

(1.82)

Actin

(0.059 59)

18SrRNA

(0.47)

Actin (2.52)

EF1-α

(0.093 73)

Actin (0.17)

18SrRNA

(2.00)

EF1-α

(0.113 28)

EF1-α

(0.68)

EF1-α

(1.00)

18SrRNA

(0.085 33)

EF1-α (0.23)

18SrRNA

(2.00)

Fbox

(0.063 14)

Fbox (0.16)

Fbox (1.59)

CYP2

(0.096 29)

CYP2 (0.22)

CYP2 (1.59)

18SrRNA

(0.082 95)

β-actin

(0.13)

18SrRNA

(1.82)

Fbox

(0.063 43)

GAPDH

(0.78)

Fbox (2.62)

18SrRNA

(0.131 49)

EF1-α (0.20)

EF1-α (2.15)

Fbox

(0.286 59)

CYP2 (0.77)

Actin (2.29)

TUB4

(0.129 85)

Actin (0.42)

TUB4 (2.08)

EF1-α

(0.083 06)

18SrRNA

(0.21)

18SrRNA

(3.30)

18SrRNA

(0.111 94)

Actin (0.24)

β-actin

(2.47)

β-actin

(0.113 25)

18SrRNA

(0.15)

Fbox (2.47)

18SrRNA

(0.076 27)

Fbox (0.79)

18SrRNA

(2.76)

CYP2

(0.175 69)

CYP2 (0.35)

Fbox (2.71)

TUB4

(0.312 81)

Actin (0.78)

TUB4 (3.30)

Actin

(0.172 59)

18SrRNA

(0.43)

Actin (2.29)

18SrRNA

(0.107 60)

EF1-α (0.31)

EF1-α (3.63)

EF1-α

(0.117 40)

EF1-α (0.28)

EF1-α (4.00)

TUB4

(0.190 89)

GAPDH

(0.22)

CYP2 (2.71)

EF1-α

(0.203 87)

Actin (0.82)

CYP2 (2.92)

Fbox

(0.211 69)

18SrRNA

(0.36)

Actin (3.48)

Actin

(0.429 88)

TUB4 (0.82)

Fbox (3.42)

β-actin

(0.378 68)

CYP2 (0.48)

β-actin

(5.31)

TUB4

(0.373 05)

Actin (0.42)

TUB4 (5.31)

Actin

(0.120 99)

β-actin

(0.29)

Actin (4.22)

Fbox

(0.204 73)

CYP2 (0.34)

TUB4 (4.93)

CYP2

(0.208 79)

CYP2 (0.93)

EF1-α (3.04)

β-actin

(0.234 98)

Fbox (0.42)

CYP2 (3.78)

CYP2

(0.521 15)

Fbox (0.85)

CYP2 (3.68)

GAPDH

(0.426 50)

β-actin

(0.60)

Fbox (6.65)

Actin

(0.381 88)

TUB4 (0.47)

Actin (5.65)

Fbox

(0.201 63)

Fbox (0.32)

Fbox (6.00)

EF1-α

(0.212 76)

TUB4 (0.45)

EF1-α (6.32)

β-actin

(0.319 37)

β-actin

(0.95)

GAPDH

(5.04)

Actin

(0.296 69)

β-actin

(0.43)

β-actin

(4.48)

β-actin

(0.658 04)

18SrRNA

(0.94)

β-actin

(6.32)

Fbox

(0.429 35)

Fbox (0.67)

CYP2 (6.84)

CYP2

(0.628 42)

CYP2 (0.69)

CYP2 (7.00)

TUB4

(0.278 32)

TUB4 (0.54)

TUB4 (7.00)

Actin

(0.287 45)

EF1-α (0.48)

GAPDH

(6.35)

TUB4

(0.384 57)

EF1-α (0.96)

β-actin

(5.65)

TUB4

(0.320 75)

TUB4 (0.48)

TUB4 (5.81)

18SrRNA

(0.895 83)

β-actin

(1.26)

18SrRNA

(6.65)

CYP2

(0.681 72)

GAPDH

(0.70)

GAPDH

(6.95)

GAPDH

(1.401 48)

GAPDH

(1.22)

GAPDH

(8.00)

GAPDH

(0.489 92)

GAPDH

(0.62)

GAPDH

(8.00)

GAPDH

(0.327 15)

Actin (0.54)

Actin (7.32)

GAPDH

(1.400 75)

TUB4 (1.09)

TUB4 (6.95)

GAPDH

(0.675 61)

GAPDH

(0.52)

GAPDH

(8.00)

GAPDH

(1.351 64)

GAPDH

(1.29)

GAPDH

(8.00)

Continued table 2

项目 软件 1 2 3 4 5 6 7 8

注：括号内为得分

续表2

25

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

3　讨 论

大豆的生长环境会影响大豆产量及质量，传

统育种方法与转基因技术比，所需要时间更长且

效率不高。在克隆抗逆性基因和研究植物抗逆性

分子机制时，需要通过qRT-PCR分析目的基因的

表达情况。为保证试验的准确性，除了RNA质量

等因素外，还要选择合适的内参基因［14］

。已有研

究表明，不存在适用于各种试验条件的稳定内参

基因［15］

。因此，需对各种非生物胁迫及不同时

期、不同组织、不同器官的大豆进行最适内参基因

的筛选。

对 15个样本进行稳定性分析，Actin、EF1-α、

Fbox、18SrRNA 基因多次在不同时期的不同组织

部位中表现出较高的稳定性，此结果与黄秋葵［16］

（EF1-α、18SrRNA）、印度南瓜［17］

（EF1-α）、翼首

草［18］

（Actin）在不同组织或不同发育时期的结果

一致。通过综合分析，Actin 基因是大豆 R3 期的

幼荚最稳定的内参基因，这与张芷睿等［19］

在“Wil‐

liams 82”品种的大豆 R3 期结果一致。在特定时

期，虽然大豆的品种不同，但可能存在同一个稳定

内 参 基 因 。 在 干 旱 、低 温 、盐 、ABA 胁 迫 下 ，

18SrRNA、Actin、EF1-α、TUB4、CYP2 基因表现稳

定性较高，ACT、18SrRNA 在低温胁迫的柑橘［20］

中

表达稳定，低温胁迫的番茄［21］

和干旱胁迫的茅苍

术［22］

中 EF1-α 基因为最适的内参基因，18SrRNA

为梭梭［23］

、黄秋葵［16］

在干旱胁迫下稳定表达的内

参基因。本试验中，CYP2、Fbox 基因在干旱胁迫

下的稳定性更高，刘伟灿等［24］

研究表明，在干旱

胁迫下大豆的根、叶最适内参基因为ACT11、Fbox；

盐胁迫下，18SrRNA 基因是大豆根、叶中稳定基

因，ACT2、18SrRNA 基因是盐胁迫下的蚕豆［10］

叶

片中的稳定基因，与本试验存在相同的结果。可

以看出，某些内参基因可以在不同条件下的不同

科、不同属植物中稳定表达。

同是豆科的不同植物，稳定表达的内参基因

却不相同。本研究结果发现，Actin 和 EF1-α 在

15 个样本中比其他基因的稳定性更高，Jian 等［3］

对大豆不同品种、不同组织、不同发育时期、不同

光处理的研究，发现EF1-α、Actin11、CYP2均稳定

表达；Kulcheski 等［25］

研究大豆在干旱胁迫条件

下，Fbox 和 Actin 基因为最适的内参基因；瓜尔豆

在干旱和盐胁迫下稳定的内参基因分别为ACT7、

EF1-α

［26］

；ACT是瓜尔豆［26］

、刺槐［27］

在渗透胁迫下

稳定的内参基因；在紫花苜蓿［28］

、大豆［8］

中 EF 为

最合适的内参基因，说明本研究结果与大多相关

报道有相同之处。Cheng等［29］

和Le等［30-31］

将大豆

在低温、ABA、干旱、盐胁迫处理下，分析最佳的内

参基因分别为 β-Tubulin、Fbox/CYP2，鹰嘴豆［32］

和黑吉豆［33-35］

的最合适内参基因为 TUB，这些内

参基因在本研究结果中也具有一定的稳定性表

达；GAPDH 在本研究中的稳定性最差，结果与

Bansal等［9］

研究结果相同，但在相关文献报道中，

GAPDH还具有一定的稳定性，其原因是否与不同

品种的大豆有关还需进一步验证。

综上，本研究利用 qRT-PCR 方法，结合 ge‐

Norm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder 等 分 析

筛选出大豆不同时期的不同组织器官、不同非生

物胁迫下根和叶中的最适内参基因或组合。经过

综合分析，在组织器官中，内参基因稳定性排序为

Actin > EF1-α > TUB4 > CYP2 > 18SrRNA > β-ac⁃

tin > Fbox > GAPDH，推荐前 5 种内参基因组合使

用；在4种非生物胁迫下，内参基因稳定性排序为

EF1-α > Actin > TUB4 > Fbox > CYP2 > β-actin >

18SrRNA > GAPDH，推荐前 4 种内参基因组合使

用。对于不同品种在不同条件下内参基因大都不

同，不能应用于所有研究中，因此还需要试验进行

稳定性内参基因的筛选和验证。该研究结果为大

豆基因功能及转基因育种等方面的研究提供理论

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及生物信息学分析［J］. 吉林农业大学学报，2021，43（5）：

524-529.

［32］ Castro P， Román B， Rubio J， et al. Selection of reference

genes for expression studies in Cicer arietinum L.： Analysis

of cyp81E3 gene expression against Ascochyta rabiei［J］. Mo‐

lecular Breeding，2012，29（1）：261-274.

［33］ Anirban K， Anju P， Amita P. Defining reference genes for

qPCR normalization to study biotic and abiotic stress re‐

sponses in Vigna mungo［J］. Plant Cell Reports，2013，32

（10）：1647-1658.

（责任编辑：王希）

27

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（1）：28-33

Journal of Jilin Agricultural University

紫萼玉簪花提取物对小菜蛾的杀虫活性测定及

其成分分析*

王艺卉1

，毕增一1

，陈思妤2

，韩东昊1

，黄钰麟1

，袁海滨1**

1. 吉林农业大学植物保护学院，长春130118；2. 东北师范大学附属中学国际部，长春130024

摘 要：测定了从紫萼玉簪花中萃取分离获得的5种提取物对小菜蛾的杀虫活性，并分析了活性较好的提取

物的化学成分。结果表明：正丁醇萃取物对小菜蛾的生物活性较好，氯仿萃取物生物活性次之，石油醚萃取

物、乙酸乙酯萃取物和水提取物的生物活性较弱。其中质量浓度为250 mg/L正丁醇萃取物对小菜蛾处理12 h

后，拒食活性达到 98%；处理 24 h 后触杀活性为 83. 33%；处理 48 h 后熏蒸活性和胃毒活性分别为 53. 63% 和

57. 78%；在同一浓度下驱避活性达到90. 48%。通过GC-MS分析从正丁醇萃取物中鉴定出28种化学成分，主

要 成 分 为 棕 榈 酸（17. 189%）、亚 油 酸（10. 041%）、丁 酸 丁 酯（8. 641%）、亚 麻 酸（8. 53%）、棕 榈 酸 丁 酯

（4. 56%）等。

关键词：紫萼玉簪；小菜蛾；杀虫活性；成分分析；萃取分离

中图分类号：S435 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0028-06

DOI：10.13327/j.jjlau.2022.5636

引用格式：王艺卉，毕增一，陈思妤，等.紫萼玉簪花提取物对小菜蛾的杀虫活性测定及其成分分析［J］.吉林农

业大学学报，2024，46（1）：28-33.

Determination of Insecticidal Activity of Hosta ventricosa Flowers Ex⁃

tracts against Plutella xylostella and Analysis of Their Chemical Com⁃

ponents

WANG Yihui1

，BI Zengyi1

，CHEN Siyu2

，HAN Donghao1

，HUANG Yulin1

，YUAN Haibin1**

1. College of Plant Protection， Jilin Agricultural University， Changchun 130118，China；2. Interna⁃

tional Department of the High School Attached to Northeast Normal University， Changchun 130024，

China

Abstract：In this study, five kinds of extracts obtained from the flowers of Hosta ventricosa were mea‐

sured for insecticidal activity against Plutella xylostella, and the chemical components of the extracts

with insecticidal activity were analyzed. The results showed that the n-butanol extract had the best

biological activity against P. xylostella. The biological activity of chloroform extract was second, and

the biological activities of petroleum ether extract, ethyl acetate extract and water extract were weak.

The antifeedant activity reached 98% at a concentration of 250 mg/L after 12 hours of treatment, the

contact activity was 83.33% after 24 hours of treatment, the fumigation activity and stomach poison‐

ing were 53.63% and 57.78% after 48 hours of treatment. The repellent activity reached 90.48% at

the same concentration. Twenty-eight chemical components were identified from the n-butanol ex‐

* 基金项目：国家自然科学基金项目（31101440），吉林农业大学国家级大学生创新创业训练计划项目（201810193035）

作者简介：王艺卉，女，在读硕士，研究方向：害虫综合治理。

收稿日期：2020-02-04

** 通信作者：袁海滨，E-mail：yhb-74@163.com

王艺卉，等：紫萼玉簪花提取物对小菜蛾的杀虫活性测定及其成分分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

tract through GC-MS analysis, and the main components were palmitic acid (17.189%), linoleic acid

(10.041%), linolenic acid (8.53%), butyl butyrate (8.641%), and butyl palmitate (4.56%).

Key words：Hosta.ventricosa；Plutella xylostella； insecticidal activity； component analysis； extrac‐

tion separation

紫萼玉簪［Hosta.ventricosa（. Salisb.）Stearm］又

名紫萼，百合科玉簪属［1-3］

，具有耐寒、喜阴的特

性［4-5］

。花淡紫色，花期较长，紫萼玉簪作为观赏

植物和药用植物应用历史已久，还具有活血散瘀、

消肿解毒、治疗跌打扭伤和胃痛的功效［6-8］

。紫萼

玉簪对土壤要求不严格，一般土质均能良好生长，

林下或路旁常见，栽植后通过根系分蘖繁殖迅速，

且耐寒力极强，是非常容易获得的植物材料。紫

萼玉簪具有很强的异株克生作用，周围其他杂草

基本不生长，而且生长过程中也没有虫害。根据

相关报道，紫萼玉簪提取物对细菌具有一定程度

的抑菌作用［9］

，紫萼玉簪提取物对稗草等农田常

见杂草的种子萌发有良好的抑制作用［10-11］

。但关

于紫萼玉簪对害虫防控的研究很少，因此，本试验

选取紫萼玉簪花为原材料，研究紫萼玉簪花提取

物对害虫的杀虫活性。

小菜蛾［Plutella xylostella（Linnaeus）］属鳞翅

目，菜蛾科，是十字花科蔬菜的重大害虫之一［12］

。

由于其体型小，繁殖力强，易产生抗性，防治较困

难［13］

，本试验利用紫萼玉簪花提取物，以小菜蛾

作为供试昆虫进行杀虫活性测定，并对活性高的

提取物进行化学成分分析，为防治小菜蛾寻找新

型植物源杀虫剂提供研究基础。

1　材料与方法

1. 1　植物材料

2019年7—9月，在吉林农业大学校园内采集

紫萼玉簪的花，阴干后粉碎备用。

1. 2　供试昆虫

小菜蛾虫源采于吉林农业大学蔬菜种植基

地，采用萝卜苗饲养法，在恒温光照培养箱内饲

养，饲养温度（25±1）℃，湿度（65±5）%，光照∶黑

暗=16∶8。

1. 3　紫萼玉簪花的初步提取

于锥形瓶中放入 20 g 紫萼玉簪花粉末，加入

95% 乙醇共计 100 mL，常温静置 2 h后，放入超声

波振荡提取器中提取50 min，用滤纸进行过滤，重

复浸泡、提取 3 次。将所得的提取物滤液减压旋

转蒸发后，于 40 ℃水浴锅中蒸干，得到浸膏，在

4 ℃下避光保存备用。

1. 4　紫萼玉簪花提取物的萃取与分离

将紫萼玉簪花提取物溶解于蒸馏水中制成悬

浮液后，倒入分液漏斗中，使用石油醚、氯仿、乙酸

乙酯和正丁醇各分级萃取 3 次，将各萃取液合并

于同一锥形瓶中，通过减压旋转蒸发得到石油醚

萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃

取物浸膏，剩余水溶性物质蒸发浓缩后，即为水提

取物。

1. 5　杀虫活性测定

1. 5. 1 触杀活性 试验采用微量点滴法。用丙

酮将各萃取物配制成质量浓度为 250 mg/L 的溶

液，每个培养皿放 10 头小菜蛾 3 龄幼虫，滴 1 µL

溶液在小菜蛾 3 龄幼虫的前胸背板上，以丙酮为

对照。在观察2，4，6，8，10，12，24 h后，记录供试昆

虫的死亡情况，每组3次重复，并计算校正死亡率。

1. 5. 2 熏蒸活性 试验采用广口瓶熏蒸法。将

各萃取物用丙酮配置成质量浓度 250 mg/L 的溶

液，每个广口瓶中放入10头小菜蛾成虫，将10 µL

供试溶液滴于 10 cm 滤纸条的顶端，待丙酮挥发

后将滤纸条悬放于广口瓶距底部 1/3 处，用封口

膜密封瓶口。以丙酮为对照，观察并记录小菜蛾

成虫在12，24，48 h的死亡情况，每组 3次重复，并

计算校正死亡率。

1. 5. 3 拒食活性 试验采用小叶碟测定法。将

各萃取物配置成质量浓度 250 mg/L 的供试溶

液，选取新鲜西兰花叶片，用打孔器将叶片打成直

径 1.5 cm 的圆形小叶碟，将小叶碟浸没在配置好

的提取物溶液中，10 s后取出晾干，将晾干的小叶

碟放入装有蒸馏水保湿滤纸的培养皿中，每个培养

皿中以十字交叉方式放入4个小叶碟。将10头经

过4 h饥饿处理的小菜蛾3龄幼虫放入培养皿中，

以丙酮溶液作为对照。12，24，48 h时测定剩余叶

碟面积，计算小菜蛾幼虫在 12，24，48 h 后已取食

的叶碟面积和拒食率。每组试验重复3次。

1. 5. 4 胃毒活性 试验方法同本文“1.5.3”拒食

活性测定方法。在 12，24，48 h后，观察并记录小

29

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

菜蛾成虫的死亡情况，计算小菜蛾幼虫的校正死

亡率。每组试验重复3次。

1. 5. 5 驱避活性 试验采用“Y”型嗅觉仪法。

将各萃取物用丙酮配制成 250 mg/L 溶液 ，滴

10 µL试液到滤纸条上，并放在一侧味源瓶内，另

一侧以丙酮为对照，管柄接真空泵，抽气速率为

400 mL/min。在“Y”型管中依次引入10头小菜蛾

成虫，10 min 后观察并记录各成虫的选择趋性。

试验重复30次。驱避等级分级标准，见表1。

1. 6　成分鉴定

气 相 色 谱 条 件 ：采 用 HP-1 毛 细 管 柱

（0.25 mm×30 m×0.25 µm）；升温程序：起始温度为

60 ℃，保持 3 min，以 10 ℃/min 升至 280 ℃，保持

5 min；进样口温度 280 ℃，载气为氦气，载气流速

2.0 mL/min，分流比为50∶1，进样量为1.0 µL。

质谱条件：采用 EI 离子源，电子能量 70 eV，

离子源温度230 ℃，扫描范围20~650 m/z，四级杆

温度150 ℃，质谱采集延迟时间2 min。采用NIST

质谱标准库检索，鉴定其化学成分，运用面积归一

化法计算各个成分的相对含量。

1. 7　数据分析方法

使用 Excel 软件整理数据，并在 DPS v7.05 平

台上采用 Duncan 氏新复极差多重比较法进行方

差分析、差异显著性检验。

2　结果与分析

2. 1　紫萼玉簪花提取物的杀虫活性

2. 2. 1 触杀活性 正丁醇萃取物对小菜蛾幼虫

的触杀活性较好，在质量浓度 250 mg/L 处理 8 h

后，小菜蛾幼虫校正死亡率达到 70% 以上，处理

24 h 后校正死亡率为 83.33%，且差异显著；氯仿

和乙酸乙酯萃取物触杀活性次之，处理 24 h 后

校正死亡率分别为 56.67% 和 45.56%；石油醚和

水提取物活性较弱，24 h 后为 27.78% 和 15.56%。

5 种萃取物的触杀活性均随着时间的增长而升

高，见表2。

2. 2. 2 熏蒸活性 正丁醇萃取物对小菜蛾成虫

的熏蒸活性较好，在质量浓度 250 mg/L处理 48 h

后，小菜蛾成虫的校正死亡率为 53.63%；石油醚

和乙酸乙酯萃取物处理组熏蒸活性次之，校正死

亡率为 49.68%，43.38%；氯仿和水提取物处理组

的小菜蛾校正死亡率仅为 34.34% 和 29.26%，熏

蒸活性最弱。5种萃取物的熏蒸活性随着时间的

增长而逐渐升高，见表3。

2. 2. 3 拒食活性 正丁醇萃取物对小菜蛾幼虫

的拒食活性较好，在质量浓度 250 mg/L 处理 12，

24，48 h 后，拒食率为 98.00%，95.35% 和 94.23%，

且与其他提取溶剂组比较差异显著；氯仿、乙酸

乙酯处理组拒食活性次之，12 h 后为 86.10% 和

84.74%；石油醚和水提取物最弱，处理 12 h 后仅

为 45.37% 和 44.34%。5 种萃取物均表现为拒食

率随时间的增加而降低的趋势，见表4。

表1 驱避等级分级标准

Table 1 Grading standards of repellent rate

等级

0

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

Ⅴ

驱避率/%

<0.1

0.1~20

20.1~40

40.1~60

60.1~80

80.1~100

表2　不同萃取物对小菜蛾幼虫的触杀活性

Table 2 Contact activity of different extracts against P. xylostella larvae %

t/h

2

4

6

8

10

12

24

校正死亡率

石油醚萃取

8.89±3.07c

11.11±2.03d

21.11±2.03c

21.11±2.03c

21.11±2.03d

21.11±2.03e

27.78±3.24e

氯仿萃取

20.00±3.07b

22.22±2.78c

42.22±4.65b

51.11±2.60b

52.22±2.22b

54.44±2.42b

56.67±2.36b

乙酸乙酯萃取

20.00±2.58b

30.00±2.89b

40.00±3.33b

42.22±3.24b

42.22±3.38c

45.56±3.38c

45.56±3.38c

正丁醇萃取

38.89±3.65a

61.11±3.51a

66.67±2.89a

73.33±3.73a

78.89±3.51a

82.22±3.64a

83.33±2.89a

水

3.33±2.11c

11.11±1.11d

11.22±1.47d

12.22±1.47d

12.22±1.47e

13.33±1.67e

15.56±1.76e

注：表中数据为平均值±标准差，同行不同字母表示在0.05水平差异显著（P＜0.05）

30

王艺卉，等：紫萼玉簪花提取物对小菜蛾的杀虫活性测定及其成分分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 2. 4 胃毒活性 氯仿萃取物和正丁醇萃取物

对小菜蛾幼虫的胃毒活性较好，在质量浓度为

250 mg/L处理48 h后，校正死亡率分别为70.00%

和 57.78%，而石油醚、乙酸乙酯和水提取物处理

组的胃毒活性较低，为37.78%，15.56%和15.56%。

5种萃取物对小菜蛾的胃毒活性均随时间的增加

而升高，见表5。

2. 2. 5 驱避活性 正丁醇萃取物对小菜蛾成虫

的驱避活性较好，驱避率达到 90.48%，驱避等级

为最高等级Ⅴ级，且显著性差异；石油醚萃取物驱

避等级也为Ⅴ级，驱避率为 85.98%；氯仿，乙酸

乙酯，水萃取物驱避等级均为Ⅳ级，驱避率分别为

78.57%，75.54%和66.86%，见表6。

表3　不同萃取物对小菜蛾成虫的熏蒸活性

Table 3 Fumgiant activity of different extracts against P. xylostell adults %

提取溶剂

石油醚

氯仿

乙酸乙酯

正丁醇

水

校正死亡率

12 h

3.33±1.67ab

3.33±2.36ab

3.33±1.11ab

5.56±2.42a

0.00±0.00b

24 h

16.42±2.61ab

8.16±3.33bc

6.99±1.11bc

24.68±3.09a

2.33±3.64c

48 h

49.68±3.77a

34.34±3.89b

43.38±3.33a

53.63±2.42a

29.26±4.08b

注：表中数据为平均值±标准差，同列不同字母表示在0.05水平差异显著（P<0.05），下表同

表4　不同萃取物对小菜蛾幼虫的拒食活性

Table 4 Antifeeding activity of different extracts against P. xylostell larvae %

提取溶剂

石油醚

氯仿

乙酸乙酯

正丁醇

水

拒食率

12 h

45.37±4.70c

86.10±1.17b

84.74±1.12b

98.00±0.44a

44.34±3.61c

24 h

41.36±2.59c

79.15±0.93b

82.68±0.44b

95.35±0.22a

40.67±1.47c

48 h

39.28±1.88d

75.45±0.73c

80.01±0.28b

94.23±0.17a

38.81±3.02d

表5　不同萃取物对小菜蛾幼虫的胃毒活性

Table 5 Stomach poisoning activity of different extracts against P. xylostella larvae %

提取溶剂

石油醚

氯仿

乙酸乙酯

正丁醇

水

校正死亡率

12 h

3.33±1.67bc

7.78±2.22b

6.67±2.36bc

21.11±3.51a

0.00±0.00c

24 h

26.67±2.89c

60.00±5.00a

6.67±2.36d

48.89±4.84b

14.44±2.94d

48 h

37.78±3.64c

70.00±4.08a

15.56±2.42d

57.78±3.24b

15.56±2.42d

表6 不同萃取物对小菜蛾成虫的驱避活性

Table 6 Repellent activity of different extracts against P. xylostella adults

提取溶剂

石油醚

氯仿

乙酸乙酯

正丁醇

水

平均驱避率/%

85.98±3.16ab

78.57±3.29bc

75.54±1.79c

90.48±2.86a

66.86±3.71d

驱避等级

Ⅴ

Ⅳ

Ⅳ

Ⅴ

Ⅳ

31

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

2. 2 紫萼玉簪花-正丁醇萃取物的化学成分分析

5 种萃取物对小菜蛾的触杀、熏蒸、胃毒、拒

食和驱避活性研究，结果表明：正丁醇萃取物对小

菜蛾的杀虫活性最高。采用 GC-MS 分析正丁醇

萃取物的化学成分，共鉴定出28种化合物，其中，

以棕榈酸（17.189%）、亚油酸（10.041%）、丁酸丁酯

（8.641%）、亚麻酸（8.53%）、棕榈酸丁酯（4.56%）

的相对含量较高（表7）。

3　讨 论

本试验测定发现，紫萼玉簪花正丁醇萃取物

对小菜蛾有较好的杀虫活性，其中触杀活性、拒食

活性、驱避活性效果显著。质量浓度为 250 mg/L

处理 24 h 后，对小菜蛾幼虫的触杀死亡率达到

80%以上；而拒食试验中，3龄幼虫的拒食率在12 h

后达到98%；在驱避试验中，对小菜蛾成虫的驱避

活性为 90.48%。紫萼玉簪花正丁醇萃取物对小

菜蛾的熏蒸活性、胃毒活性较弱，在熏蒸试验中，

处理 48 h 后对小菜蛾成虫的校正死亡率达到

53.63%；在胃毒试验中，处理 48 h 后小菜蛾幼虫

校正死亡率为57.78%。

相关研究发现，不同植物萃取物对小菜蛾的

杀虫活性不同，大青叶正丁醇萃取物对小菜蛾有

较好的胃毒活性［14］

；五味子油、果实、藤茎正丁醇

萃取物对小菜蛾有良好的毒杀和驱避活性［15］

；牵

牛子正丁醇萃取物对小菜蛾3龄幼虫有很强的拒

食和触杀活性［16］

。而本试验中紫萼玉簪花的正

表7 紫萼玉簪花正丁醇萃取物的化学成分及其相对含量

Table 7 Chemical mponents and relative contents of N-Butyl alcohol from flowers of Hosta ventricosa

序号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

保留时

间/min

3.126

3.494

4.467

5.217

5.467

5.927

5.973

6.433

6.703

7.439

7.610

8.708

9.280

10.668

14.199

14.718

15.310

17.690

17.900

18.814

18.860

18.959

18.979

19.104

19.755

20.103

20.149

20.840

相对含量/%

1.787

0.423

0.812

0.988

0.538

1.803

4.683

1.240

8.641

1.126

2.121

1.033

0.995

2.550

3.674

3.253

10.315

17.189

1.309

10.041

8.530

1.332

1.709

4.560

1.736

4.065

2.167

1.380

化学名称

2,3-丁二醇

乙酸丁酯

4-庚酮

异丁酸异丁酯

3-甲基-4-庚酮

异丁酸丁酯

丁酸异丁酯

异丁基硫醚

丁酸丁酯

3-hydroxy-4,4-dimethyldihydro-2(3H)-furanone

苯乙醛

5-O-Methyl-d-gluconic acid dimethylamide

3,5-dihydroxy-6-methyl-2,3-dihydro-4H-pyran-4-one

5-羟甲基糠醛

1,6-脱水吡喃葡萄糖

3-羟基-4-甲氧基苯甲酸

5-(Cyclohexylmethyl)pyrrolidin-2-one

棕梠酸

十六酸乙酯

亚油酸

亚麻酸

十八酸

亚油酸乙酯

棕榈酸丁酯

正二十三烷

9,12-十八二烯酸丁酯

9,12,15-十八二烯酸丁酯

二十六烷

CAS 号

513-85-9

123-86-4

123-19-3

97-85-8

15726-15-5

97-87-0

539-90-2

592-65-4

109-21-7

79-50-5

122-78-1

13096-67-8

28564-83-2

67-47-0

498-07-7

645-08-9

14293-08-4

57-10-3

628-97-7

60-33-3

463-40-1

57-11-4

544-35-4

111-06-8

638-67-5

630-01-3

化学式

C4

H10O2

C6

H12O2

C7

H14O

C8

H16O2

C8

H16O

C8

H16O2

C8

H16O2

C8

H18S

C8

H16O2

C6

H10O3

C8

H8

O

C9

H19NO6

C6

H8

O4

C6

H6

O3

C6

H10O5

C8

H8

O4

C11H19NO

C16H32O2

C18H36O2

C18H32O2

C18H30O2

C18H36O2

C20H36O2

C20H40O2

C23H48

C22H40O2

C22H38O2

C26H54

相对分

子量

90

116

114

144

128

144

144

146

144

130

120

237

144

126

162

168

181

256

284

280

278

284

308

312

324

332

334

366

32

王艺卉，等：紫萼玉簪花提取物对小菜蛾的杀虫活性测定及其成分分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

丁醇萃取物对小菜蛾具有较高的触杀活性、拒食

活性、驱避活性，可能不同植物材料的提取物对昆

虫的杀虫活性各有差异。

采用 GC-MS 分析正丁醇萃取物共鉴定出

28 种 化 学 成 分 ，以 棕 榈 酸（17.189%）、亚 油 酸

（10.041%）、丁酸丁酯（8.641%）、亚麻酸（8.53%）、

棕榈酸丁酯（4.56%）的含量最高。

有文献研究表明，棕榈酸、亚油酸具有较好的

杀虫活性。中华猕猴桃茎中具有杀虫活性的成分

主要为棕榈酸、亚油酸等［17］

；乳化后的亚油酸可

有效杀死棉铃虫的幼虫［18］

；Ramsewak 等［19］

从沼

泽革木种子的正己烷提取物中分离出亚油酸和油

酸，对第 4 龄埃及伊蚊幼虫具有杀虫作用；Rahu‐

man等［20］

从石杉中分离出来的亚油酸具有杀蚊活

性；Don-Pedro［21］

发现植物油中脂肪酸成分对四

纹豆象具有杀虫活性。本试验中生物活性最好的

正丁醇萃取物的成分分析中，主要成分也是棕榈

酸、亚油酸、亚麻酸等，所以对小菜蛾有很好的杀

虫活性。

本研究利用紫萼玉簪花萃取物对小菜蛾进行

杀虫活性测定，结果表明：紫萼玉簪花正丁醇萃取

物有良好的触杀、驱避和拒食活性，也具有一定的

熏蒸及胃毒活性。利用 GC-MS 技术鉴定正丁醇

萃取物中主要成分为棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、丁

酸丁酯和棕榈酸丁酯，初步推断棕榈酸、亚油酸和

亚麻酸为紫萼玉簪花提取物的主要杀虫活性。但

目前本试验仅对紫萼玉簪花正丁醇萃取物中化学

成分进行了初步分析，单一化学成分对小菜蛾的

杀虫活性还有待进一步研究。

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（责任编辑：王希）

33

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（1）：34-39

Journal of Jilin Agricultural University

玉米茎腐病病原菌 Fusarium graminearum 拮

抗真菌的筛选与鉴定*

赵子健，王 瑶，张逸凡，邓 颖，张 丹，王晓梅**

吉林农业大学植物保护学院，长春 130118

摘 要：针对吉林省玉米茎腐病的主要优势致病菌禾谷镰孢菌进行拮抗菌株的筛选和鉴定，为玉米茎腐病生

防菌剂的研制奠定基础。从300份土壤中分离出685个菌株，选取生长势较好的212个菌株，分别与禾谷镰孢

菌进行平板对峙试验，筛选出拮抗效果较好的拮抗菌株5株。将这5株菌进行抑菌试验，其中M-43号菌株抑

菌率最高，为75. 71%，选取M-43号真菌菌株进行后续研究。基于形态学显微观察和ITS序列分析，鉴定M-43

号菌株为Talaromyces pinophilus，该种菌为吉林省新纪录种。

关键词：玉米茎腐病；拮抗菌株；Fusarium graminearum；Talaromyces pinophilus

中图分类号：S435. 131 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0034-06

DOI：10.13327/j.jjlau.2020.5574

引用格式：赵子健，王瑶，张逸凡，等.玉米茎腐病病原菌Fusarium graminearum 拮抗真菌的筛选与鉴定［J］.吉

林农业大学学报，2024，46（1）：34-39.

Screening and Identification of Antagonistic Fungi against Fusarium

graminearum, a Pathogen of Corn Stalk Rot *

ZHAO Zijian，WANG Yao，ZHANG Yifan，DENG Ying，ZHANG Dan，WANG Xiaomei**

College of Plant Protection， Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China

Abstract：Screening and identification of antagonistic strains against Fusarium graminearum, the

main dominant pathogen of corn stalk rot in Jilin province, lays the foundation for the development of

biocontrol agents for corn stalk rot. The experimental results are as follows: 685 strains were isolated

from 300 parts of soil, and 212 strains with good growth potential were selected to conduct a plate-toplate test with Fusarium graminearum, and 5 antagonistic strains with better antagonistic effect were

selected. Five strains were tested for bacteriostasis. Among them, the bacteriostasis rate of M-43

strain was 75.71%, and the bacteriostasis rate was the highest. M-43 fungus strain was selected for

subsequent experimental research. Based on morphological microscopy and ITS sequence analysis,

strain M-43 was identified as Talaromyces pinophilus, and this species was a new record species in

Jilin province.

Key words：corn stalk rot； antagonistic bacteria；Fusarium graminearum；Talaromyces pinophilus

玉米茎腐病是世界性范围的玉米病害，危害

严重，很难防治。在吉林省常年发生，一般年份发

病率 10%~20%，严重时可达 50% 以上［1］

，是玉米

大斑病、小斑病、丝黑穗病以后又一亟待解决的重

* 基金项目：国 家 重 点 研 发 计 划 项 目（2016YFD0201004，2016YFD0200708，2018YFD0201200），吉 林 省 科 技 发 展 计 划 项 目

（20200404015YY）

作者简介：赵子健，男，硕士研究生，研究方向：植物病害综合治理。

收稿日期：2019-12-27

** 通信作者：王晓梅，E-mail:wxm820@126.com

赵子健，等：玉米茎腐病病原菌Fusarium graminearum拮抗真菌的筛选与鉴定

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

要病害。该病属于典型的土传病害，病菌在病残

体组织内外、土壤中存活越冬，成为翌年主要侵染

源。连作年限越长，土壤中积累病菌越多，发病越

重［2］

。截至目前，引起玉米茎腐病的主要致病菌

分为以下 4 类，腐霉菌（Pythium）是主要病原菌，

其中禾生腐霉菌（P. graminicola）、肿囊腐霉菌（P.

inflatum）是常见致病菌［3］

；镰孢菌（Fusarium）为主

要致病菌，以禾谷镰孢菌（F. graminearum）和串珠

镰孢菌（F. moniliforme）为主；腐霉菌和镰孢菌交

互作用复合侵染；腐霉菌与镰孢菌都是主要致病

菌［4-6］

。研究表明，同一地区不同时间分离的致病

菌也不相同。在我国吉林地区，茎腐病的优势致

病菌是禾谷镰孢菌（F. graminearum），又称禾谷镰

刀菌，属半知菌类。

目前对玉米茎腐病的防治采取选育和推广抗

病品种为主，同时加强栽培管理和进行种子处理

为辅的综合防治措施［7］

。首先是选用抗病品种，

实践证明，种植抗病品种是防治此病经济有效的

根本措施［8］

。其次是农业防治，玉米与其他非寄

主作物轮作 2~3 年可减少病原菌的积累，减轻发

病；北方春玉米区，如辽宁、吉林、内蒙古和河北北

部地区可适当晚播，减轻发病，但要注意品种的生

育期；施足基肥，氮、磷、钾配合施用［9］

，不要偏施

氮肥和追肥过晚，要增施钾肥［10-13］

；合理密植，及

时排灌水。同时注意田间卫生，收获后及时清除

田间病残体，集中烧毁或处理，病重地块不能根茬

还田。再次是种子处理，针对土壤和种子带菌情

况，一般可用种衣剂等，近几年，种子包衣起一定

的作用，但药效不好，今后应积极筛选更好的药

剂，同时注意持效期。最后是生物防治，目前已

证明对茎腐病有防治作用的生防菌有鞍形小球

皮壳菌（Sphaerodermella helvellae）、粉红黏帚霉菌

（Glioecladium roseum）、粉红单端孢菌（Trichothe⁃

cium toseum）、简 单 节 葡 孢 菌（Gonatobotrys sim⁃

plex）、棘 腐 霉 菌（Pythium acanthicum）、外 担 菌

（Exobasidiuom sp.）和木霉菌（Trichoderma sp.）［14］

。

目前我国化学防治玉米茎腐病的方法不够理想，

效果不显著。而生物防治具有安全、对环境污染

小等优点，在植物病害防治和生产中日益受到重

视［15］

。近年来，从土壤中分离拮抗菌，利用拮抗

菌来进行病害防治工作，已经成为植物病害防治

研究的热点，可作为今后挖掘菌制剂控制病害深

入研究的一条途径，具有广阔的发展前景。关于

生物防治方法防治玉米茎腐病害已有一些研究报

道，放线菌和细菌研究报道较多，而真菌相对较

少。本研究筛选到新的真菌拮抗菌株，将为生防

菌的开发提供珍贵的资源［16］

。

1　材料与方法

1. 1　试验材料

1. 1. 1 供试土样 从 2018 年 5 月开始，在吉林

省长春市及周边玉米种植区采集根际土壤样本

300份。

1. 1. 2 供试靶标菌株 玉米茎腐病主要致病菌

禾谷镰孢菌（F. graminearum）由吉林农业大学植

物保护学院植物病理教研室提供。

1. 1. 3 供试培养基及试剂 供试培养基：PDA

培养基、孟加拉红培养基、燕麦琼脂培养基、查氏

酵母膏琼脂［17-18］

。DNA 提取及电泳所用试剂：十

六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、EDTA、Tris、NaCl、

CCl4、无水乙醇、异戊醇、DNA Marker DL2000、

DNA Marker DL15000、EB、琼脂糖。

1. 1. 4 试验仪器 试验所需仪器见表1。

1. 2　试验方法

1. 2. 1 土样的采集及处理 采用五点取样法，

选取地表下 10 cm深的土壤，每个点取 40 g土样，

除去土样中过多水分。用塑料袋装好，当天不能

进行分离的土样存于 4 ℃冰箱，存储时间不超过

3 d，也可以将土样风干后置于阴凉处保存，切勿

使土样发霉受潮，然后将土样进行编号，存放于冰

箱中，待分离。

1. 2. 2 真菌菌株的分离、纯化及保存 （1）配制

土样悬浮液：风干过后的土样进行过筛，取10 g加

表1 供试仪器

Table 1 Test equipment

仪器名称

超净工作台（S.SW-CJ-2FD）

高速冷冻离心机（TG16-WS）

恒温水浴锅(DK-S220)

振荡器(QL-866)

微移液器（吉尔森）

PCR扩增仪(MG48+)

电泳仪(DYY-6C)

紫外与可见光分析装置(FR-200)

自动制冰机(SIM-F124)

生产厂家

上海跃进医疗器械厂

长沙湘仪离心机仪器有限公司

上海精宏实验设备有限公司

麒麟医用仪器厂

上海华运分析仪器有限公司

杭州郎基科学仪器有限公司

北京市六一仪器厂

上海复日科技有限公司

日本三洋公司

35

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

入盛有 90 mL 灭菌水的三角瓶中，此时土壤被稀

释成 10 倍的土壤悬液。将该土壤悬液放入摇床

中 160 r/min 振荡 30 min。取灭菌过的 1 mL的移

液管，吸取振荡后的土壤悬浮液 1 mL，放入盛有

9 mL 无菌水的试管中，此时土壤悬液被稀释为

102

倍。重复上述步骤，将土壤悬浮液分别稀释为

103

倍，104

倍，105

倍的土壤悬液。（2）拮抗真菌的分

离与纯化：土壤真菌分离纯化采用涂布法。取上

述稀释103

倍，104

倍，105

倍的土壤悬液各 0.1 mL，

分别加人到不同的 PDA 培养基平板上，用无菌玻

璃棒涂抹均匀后倒置，28 ℃下恒温培养。培养 4~

5 d后开始计数单菌落，并纯化至PDA 平板上继续

培养，同时转接到PDA 斜面培养基上培养备用。

1. 2. 3 拮抗真菌菌株初筛和复筛 （1）生长势

筛选。在9 cm PDA培养基平板上，距离培养皿边

缘1 cm处呈正三角形取3点，在其中心取1点，总

共 4 点。用 8 mm 打孔器取玉米茎腐病菌接种在

中心点上，取分离纯化好的单一真菌菌落接种在

另外 3点上，于 21~23 ℃条件下培养观察，选取菌

落生长势快的菌株为进一步的试验目标。

（2）拮抗真菌的初筛。采用平板对峙法，每组

设置 3次重复，置于 25 ℃恒温霉菌培养箱中。通

过空白对照培养皿中菌种生长情况来观测试验组

病原菌菌丝的生长状况。

（3）拮抗真菌的复筛。首先进行真菌发酵液

制备，在 PDA培养基上活化具有拮抗作用的真菌

后，以直径为5 mm打孔器打取菌饼，放入 PD液体

培养基中，每个三角瓶放2片菌饼，25 ℃，175 r/min

振荡培养 7 d，将所得培养液用 4 层纱布过滤后，

以 6 000 r/min 离心 15 min，取其上清液，最后用

0.45 µm的过滤器进行过滤，即得无菌发酵液。

（4）抑菌试验。将制备的发酵液与 PDA培养

基进行混合，比例为1∶5制备成培养基，同时设置

对照（ck）。用直径为8 mm的打孔器打取禾谷镰孢

菌菌饼，将其接入至平板，设置3次重复，25 ℃培养箱

中培养7~10 d，采用十字交叉法划线，计算抑制率：

抑制率（%）=［（对照菌落直径-处理菌落直径）/

（对照菌落直径-菌饼直径）］×100。

1. 2. 4 拮抗真菌菌株的形态学鉴定 将供试土

壤真菌在PDA培养基上于25 ℃培养48 h后，观察

菌落的质地，菌落形成是凸起的或者有成簇的菌

丝体，菌落正面和背面的颜色，有无色素渗入培

养基中。部分菌落颜色会随时间的改变进而产生

变化。25 ℃下培养至真菌大量产孢后，在洁净的载

玻片中央滴1滴KOH，用解剖针挑取少许孢子，置

于载玻片上的KOH液滴中，加上盖玻片制得临时玻

片，显微镜下观察孢子的形态及产孢结构等特征。

1. 2. 5 拮抗真菌菌株的分子生物学鉴定 （1）使

用 DNA 试剂盒提取菌株的 DNA。（2）PCR 扩增反

应。PCR 反应循环参数：94 ℃预变性 4 min；94 ℃

变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30次

循环；72 ℃进行延伸，温浴10 min，4 ℃环境下保存。

（3）PCR产物电泳检测。以DNA Marker DL2000作

为分子量标准，在FR-200紫外与可见电泳分析装

置上观察并照相。（4）PCR纯化产物的序列测定及

分析。将 PCR 产物送到上海生工进行纯化测序，

将得到的序列在NCBI数据库中进行相似性分析。

2　结果与分析

2. 1　土壤真菌菌株的分离

从 300 份采集到的土样中共分离得到 685 株

真菌菌株，分别纯化保存，备用。

2. 2　拮抗真菌菌株的筛选

2. 2. 1 生长势筛选 将分离得到的 685 株菌株

进行生长势的筛选，筛选出 212 株生长势较好的

菌株，准备进行拮抗菌初筛试验。

2. 2. 2 拮抗菌株的初筛 将分离得到的菌株进

行拮抗菌株的初筛，得到具有拮抗效果较好的拮

抗真菌菌株5株。

2. 2. 3 拮抗菌株的复筛 将初筛得到的 5 种菌

株制成发酵液进行复筛，发酵液平均抑菌率

见表2。

从表 2 中结果可知，M-43 抑菌率为 75.71%，

所以选取 M-43 为后续试验对象。M-43 抑菌效

果见图1。

表2　菌株发酵液对玉米茎腐病的抑菌效果

Table 2 Antibacterial effects of strains on corn stalk

rot

拮抗真菌

M-48

M-43

M-6

M-104

M-34

菌落直径/mm

处理

45

22

42

37

57

对照

75

75

75

75

75

抑菌率/%

44.71

75.71

49.25

56.71

26.85

36

赵子健，等：玉米茎腐病病原菌Fusarium graminearum拮抗真菌的筛选与鉴定

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 3　拮抗真菌菌株的鉴定

2. 3. 1 形态学鉴定 PDA 培养基培养 7 d，直径

18~22 mm，质地绒状兼絮状；菌丝体白色至淡黄

色，黄色近杏黄色，近于绿黄色，且菌落中心有脐

状凸起，菌落边缘整齐。反面黄褐色或橙褐色，有

色素产生。该菌落形态特征符合《中国真菌志》第

三十五卷青霉属及其相关有性型属［19］

嗜松青霉

的形态学特征，菌落生长见图2。

对M-43拮抗菌进行显微结构观察，分生孢子

梗的顶端通常明显膨大，帚状双轮生，梗基可达

12 个，大小为（9.0~12）×（2.5~3.03） µm。分生孢子

呈球形或椭圆形，大小为（2.5~3.0）×（2.2~2.83） µm，

直径或长轴通常<3 µm。显微结构参考《中国真菌

志》第三十五卷青霉属及其相关有性型属［19］

，同

样符合嗜松青霉的描述，显微结构图见图3。

2. 3. 2 分子生物学鉴定 提取拮抗菌株 DNA，

选 用 通 用 引 物 ITS1 5'-TCCGTAGGTGACCTGC

GG-3'和 ITS4 5'-TCCCGCTTATTGATATATAGC3'，进行PCR扩增，委托上海生工进行测序。将所

得碱基序列在基因库中进行比对，比较其与其他

真菌的同源性，发现 M-43 拮抗真菌与 Talaromy⁃

ces pinophilus 同源性最高，同源率达 99.47%。使

用MEGAR软件挑选最适合模型，用最大似然法构

建系统发育树，见图4，在NCBI上查阅T. pinophilus

相关属和相关种的序列建立系统发育树，通过构

建的系统发育树显示 Trichocoma paradoxa 遗传距

离最大，所以将 T. paradoxa 作为外群，M-43 拮抗

菌株明显与 T. pinophilus 划分在同一个 CLAD 中，

进 而 从 分 子 学 角 度 辅 助 证 明 了 M-43 菌 株 为

T. pinophilus。在Index Fungorum中进行菌种名更

迭查询，结果显示 2011 年以前，该菌为青霉属

的嗜松青霉（Penicillium korosum）。试验将得到

的 该 基 因 序 列 在 基 因 库 中 注 册 ，注 册 号 为

MN006617。

A.3 d时PDA正面菌落形态；B.3 d时PDA背面菌落形态；C.7 d时PDA正面菌落形态；D.7 d时PDA背面菌落形态

图2 M-43拮抗菌

Fig. 2 M-43 antagonistic bacteria

图1 M-43发酵液抑菌效果

Fig. 1 Antibacterial effect of fermentation broth of M-43

37

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

3　讨 论

本试验采集了吉林省周边地区土样 300 份，

得到优势菌株 212 种，筛选出有拮抗效果的菌株

5 种。通过发酵液抑菌率复筛，确定具有较好拮

抗效果的菌株 M-43，平均抑菌率可达 75.71%。

经过形态学鉴定、分子学鉴定及构建系统发育树，

确定拮抗菌M-43为T. pinophilus。通过试验证明

了 T. pinophilus 对禾谷镰孢菌有较好的拮抗效

果。在Index Fungorum以及NCBI菌种查询发现，

T. pinophilus 菌种为吉林省新记录种［19-20］

，这使得

本试验在筛选到新的禾谷镰刀菌拮抗菌株的同

时，也更新了吉林省菌种记录，为以后吉林省菌种

分类研究提供了一份资源。目前对生防菌的研究

多集中在细菌和放线菌上，本试验筛选得到的生

防真菌菌株，为菌制剂的开发利用提供了宝贵的

经验。

有研究表明，根际微生物对土壤中元素循环

及有机质的分解和转化具有重要作用。解磷微生

物是一类重要的根际微生物，它可将土壤中难溶

性磷转化为植物可利用的可溶性磷。解磷微生物

主要包括解磷细菌、解磷真菌及解磷放线菌等，其

中解磷真菌种类少于解磷细菌，但其溶磷能力及

遗传稳定性均高于解磷细菌。本试验筛选出的生

防菌株 T. pinophilus 对土壤中的磷元素有一定的

分解效果，把土壤中有机磷分解成无机磷，可供植

物直接吸收利用［21］

。它也具有降解草甘膦的效

果，最高降解率高达 49.6%［22-23］

，这使得该试验更

具备生产实际指导价值，增加了其生产应用的可

能性。通过本试验的研究，同时结合相关文献报

道，确定 T. pinophilus 具有开发成生防菌剂的潜

能，可以为我国生物防治提供丰富的资源［24］

。下

一步试验内容应从 T. pinophilus对串珠镰孢菌（F.

moniliforme）、肿囊腐霉菌（P. inflatum）致病菌拮

抗效果进行研究，以及 T. pinophilus 生防菌发酵

液营养条件优化、稳定性、粉剂的开发及盆栽和田

A.分生孢子梗；B.分生孢子

图3 M-43拮抗菌显微结构图

Fig. 3 Antimicrobial structure of M-43 antagonist

图4　基于ITS构建系统发育树

Fig. 4 Building a phylogenetic tree based on ITS

38

赵子健，等：玉米茎腐病病原菌Fusarium graminearum拮抗真菌的筛选与鉴定

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

间试验展开进一步的研究，为进行新型菌制剂制

作做好准备工作［25-27］

。

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（责任编辑：王希）

39

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（1）：40-48

Journal of Jilin Agricultural University

解淀粉芽孢杆菌 AW3 诱导发病红松的抗病

机制*

张 平，刁 健，王立海**

东北林业大学森林持续经营与环境微生物工程黑龙江省重点实验室，哈尔滨 150040

摘 要：为探究植物根际促生菌（PGPR）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacien）AW3 对尖孢镰刀菌（Fu⁃

sarium oxysporum）侵染下红松（Pinus koraiensis）抗病的影响，在温室条件下，使用解淀粉芽孢杆菌AW3发酵液

诱导发病红松幼苗，测定红松根腐病相对防治效果及可溶性蛋白、可溶性糖、苯丙氨酸氨解酶（PAL）、过氧化

氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗病相关基因等指标。结果表明：菌株AW3对红松根腐病的温室防效

为 79. 3%，接种红松后，能诱导红松更迅速地产生细胞防卫反应，活性氧和细胞膜透性相对染色强度分别为

对照组的 2. 57 倍和 2. 98 倍，差异显著（P<0. 05）；红松幼苗体内可溶性糖和可溶性蛋白含量均显著增加，

SOD、POD以及CAT酶的活力显著提高，并且诱导了茉莉酸、水杨酸和与生长素信号转导相关基因的转录。总

之，在尖孢镰刀菌的侵染下，菌株 AW3诱发了发病红松的抗病机制，在防御相关酶和抗病基因的综合作用下

减缓了红松病害的发生。可见，菌株AW3是一种非常有效的细菌，可用于控制红松根腐病。

关键词：生物防治；芽孢杆菌；诱导抗病；红松；根腐病

中图分类号：S763. 1 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0040-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.5516

引用格式：张平，刁健，王立海.解淀粉芽孢杆菌AW3诱导发病红松的抗病机制［J］.吉林农业大学学报，2024，

46（1）：40-48.

Disease Resistance Mechanism of Pinus koraiensis Induced by Bacil⁃

lus amyloliquefaciens AW3

ZHANG Ping，DIAO Jian，WANG Lihai**

Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Forest Sustainable Management and Environmental Micro⁃

bial Engineering， Northeast Forestry University， Harbin 150040，China

Abstract：The aim of the present study was to investigate the effect of plant growth-promoting rhizo‐

bacteria (PGPR) Bacillus amyloliquefacien AW3 strain on disease resistance in Pinus koraiensis in‐

fected with Fusarium oxysporum. P. koraiensis saplings were inoculated with AW3 using fermenta‐

tion liquor under greenhouse conditions. Relative control factors of root rot such as soluble protein,

soluble sugar, phenylalanine ammonia lyase (PAL), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and

disease resistance related genes were determined. The results indicated that the inhibitory effect of

AW3 on root rot in P. koraiensis was remarkably high (79.3%). AW3 induced a rapid generation of

cell defense in P. koraiensis after inoculation of AW3 in P. koraiensis. The relative staining intensity

of reactive oxygen species (ROS) was 2.57 and cell membrane permeability was 2.98 times that of the

* 基金项目：国家自然科学基金项目(31570547)，双一流创新人才培养专项（000/41113102）

作者简介：张平，男，在读博士，研究方向：有害生物综合防治。

收稿日期：2019-12-04

** 通信作者：王立海，E-mail：wanglihai@nefu.edu.cn

张平，等：解淀粉芽孢杆菌AW3诱导发病红松的抗病机制

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

control group, and the difference was significant (P<0.05). The content of soluble sugar and suluble

protein of P. koraiensis saplings increased significantly (P<0.05). AW3 significantly increased the ac‐

tivity of SOD, POD and reduced CAT. AW3 also induced transcription of jasmonic acid (JA), sali‐

cylic acid (SA), and genes involved in auxin signaling. In summary, AW3 induced disease resistance

against F. oxysporum infection in P. koraiensis and reduced occurrence of the disease through a com‐

bined action of defense-related enzymes and resistance genes. AW3 is a very effective bacterial

strain that can be used to control root rot in P. koraiensis, however further studies on the development

of biologics using AW3 and its field applications are advocated.

Key words：biocontrol；bacillus；induction of disease resistance；Pinus koraiensis；root rot disease

激发植物防御机制是控制病害的一种有利方

式，并且可能成为化学防治的替代方法［1］

。植物

根际促生细菌（PGPR）被认为是激发植物防御的

诱导剂。一些相关研究表明，PGPR 在体外条件

下能够诱导多种植物的系统抗性（ISR），如拟南芥

（Arabidopsis thaliana）、番茄（Lycopersicon esculen⁃

tum Mill.）、黄瓜（Cucumis sativus L.）和烟草（Nico⁃

tiana tabacum L.）［2-3］

。PGPR 诱导的植物系统抗

性（ISR）在表型上类似于植物的系统获得性抗性

（SAR）［4］。 但 是 ，ISR 的 信 号 转 导 途 径 不 同 于

SAR。ISR 主要以茉莉酸和乙烯（JA/ETH）作为

信号分子，可以诱导寄主植物细胞物理结构发生

变化。此外，还能催化参与植物抗病相关多种酶

的活性，例如苯丙氨酸氨解酶（PAL），过氧化氢

酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）［5-6］

。而水杨

酸（SA）是 SAR 信号通路的信号分子，主要特征

在于诱导与病程蛋白（PR）相关基因的表达。PR

是一种水溶性蛋白，可以攻击病原体，降解细胞

壁大分子，并抑制病毒外壳蛋白与植物受体分子

的结合，如 PR1、PR2 和 PR5

［7-9］

。PGPR 可以在植

物受到病原菌的侵染后，通过激活防御相关基因

的表达而赋予植物抗性，因此，PGPR 对于降低由

疾病引起的植物死亡率有至关重要的作用［10-11］

。

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）在世界各

地广泛分布，在某些特定环境下，该菌可从兼性寄

生变为营养寄生，导致植物根部腐烂、枯萎和死

亡［12］

。红松属于国家濒危树种，是世界上最耐火

的树木，也是为数不多的能够经受低温和干旱条

件的树种之一，在俄罗斯、韩国、朝鲜和中国东北

部地区均有种植。尽管红松可以忍受干旱和低温

胁迫，并且能抵御多数的病虫害，但是尖孢镰刀菌

的侵染会使苗圃地中的红松幼苗大量死亡。染病

红松地上部叶片萎蔫、黄化、干枯，地下部根部腐

烂、表皮破损，严重时整株植物死亡［13］

。截至目

前，使用杀菌剂（多菌灵）灌根仍然是控制该病的

主要方法。而减少化学农药的使用，实现可持续

发展是研究的重点。在这种情况下，与化学防治

相比，生物防治被认为是更加符合环境友好型的

方法［14］

。

本研究在温室条件下，测定了解淀粉芽孢杆

菌AW3对发病红松的相对防治效果，并探讨在其

诱导下红松的防御机制。

1　材料与方法

1. 1　供试材料

1. 1. 1 植物材料 红松育苗在东北林业大学温

室大棚中进行，生长温度为 30 ℃，每日光照 16 h。

红松通过种子种植，种植在混合土中［m（黑土）∶

m（蛭石）∶m（发酵牛粪）=75∶20∶5］，每 10 d 浇水

1 次，每盆浇水 50 mL。选取生长周期 1 年，健康

和株高一致的盆栽苗进行试验，该种植品种对尖

孢镰刀菌表现出高度感病。

1. 1. 2 菌株和试剂 菌株来源：尖孢镰刀菌菌

株分离来自发病的红松根部，该菌株保藏于东北

林业大学林学院微生物保藏室。解淀粉芽孢杆菌

（Bacillus amyloliquefacien）命名为 AW3，该菌株从

芜菁（Brassica rapa L.）变态根内分离，菌株保藏于

中 国 普 通 微 生 物 菌 种 保 藏 中 心 ，保 藏 编 号 ：

CGMCC 1.16683。

主要试剂：反转录试剂盒、荧光定量染料

［RR047B，宝生物工程（大连）有限公司］、RNA提

取试剂盒（RP3501 型，北京百泰克生物技术有限

公司）。

1. 2　方法

1. 2. 1 菌株 AW3 诱导后对发病红松的防效测

定 使用前分别将尖孢镰刀菌和菌株 AW3 在

41

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

26 ℃条件下，于 PDA培养基上培养 7 d，而后转接

到 PD 液体培养基中，在 28 ℃条件下以 160 r/min

恒温振荡7 d，通过紫外分光光度计测定光密度值，

OD600参数下，浓度约为 1.9×108

~2.0×108

CFU/mL

（其中 CFU 为菌落数）。处理组和对照组预先将

终浓度为 1.8×108

CFU/mL 的尖孢镰刀菌发酵

液以灌根方式接种，每盆接种量 50 mL，10 d 后

再通过灌根方式将芽孢杆菌发酵液按照每盆

50 mL 的含量接种，对照组接种同体积的无菌

水。每个处理 12 株，3 次重复。根据 Hernández

等［15］

所述的研究方法，于 10，15，25，30 d 分别根

据 0~4 量级，统计地上部叶片发病程度（叶片黄

化或坏死程度，其中量级 0 为 0，量级 1 为 1%~

33％，量级 2 为 34%~66％，量级 3 为 67%~100％，

量级 4 为死亡植物）的百分比。参照 Evenhuis［16］

等方法，根据发病程度，通过公式计算病情指数

和防效：

病情指数=［∑（病级株数×代表值）/（总株

数×最高病级代表值）］×100%，防效（％）=（对照病

情指数-处理病情指数）/（对照病情指数）×100。

1. 2. 2 菌株 AW3 诱导后红松 SOD、PAL 和 CAT

酶活性的测定 分别在距离试验结束的 72，36，

12，6，0 h 之前接种细菌，随后每个处理组统一采

集 12 棵红松叶片，随机混合后，将样品转移至

-20 ℃预先预冷的研钵中，加入液氮后充分研磨，

用药勺将研磨好的叶片组织转移到 1.5 mL 离心

管中，按m（叶片组织）∶V（0.02~1 mol/L磷酸缓冲液）=

1∶9比例混合后，涡旋振荡1 min，于3 000 r/min 4 ℃

离心 10 min，取 50 µL 上清液加入 5 mL 的离心管

中，根据试剂盒（CAT A007~1~1，SOD A001~4，

PAL A137，南京建成科技有限公司）说明书，在对

照管和测定管中依次加入试剂，涡旋振荡充分混

匀，比色法测吸光值，根据说明书中的公式依次计

算酶活力。

1. 2. 3 菌株AW3诱导后红松可溶性蛋白和可溶

性糖含量测定 分别在距离试验结束的 72，36，

12，6，0 h 之前接种细菌，随后每个处理统一采集

12棵红松苗叶片，用0.9％的生理盐水冲洗后随机

混合，装入5 mL离心管内迅速液氮冷冻，于-80 ℃

冰箱中保存备用。分别采用苯酚法和考马斯亮蓝

G250 法［17］

测定可溶性糖和可溶性蛋白含量。称

取 200 mg 叶片，洗净剪碎后放入 50 mL 离心管

中，加入 5 mL 去离子水后，于 100 ℃水浴加热

30 min，使用无菌滤纸过滤组织液并稀释 5 倍

后，取 0.5 mL 稀释液用于可溶性糖含量的测定。

同样称取 200 mg 红松叶片，加入 5 mL 去离子水

和少量石英砂磨成匀浆，将匀浆液于 6 000 r/min

条件下离心 5 min，上清液稀释 5 倍后，取 0.1 mL

稀释液置于离心管中，用于可溶性蛋白含量的

测定。同时，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品制

作标准曲线，在标准品及样品试管中分别加入

5 mL 考马斯亮蓝 G250，混匀并静置 5 min 后，在

595 nm 条件下测定吸光值，计算可溶性蛋白的

含量。

1. 2. 4 菌株AW3诱导后红松植株细胞膜透性和

活性氧染色测定 在接种细菌 30 d后终止试验，

取发病 30 d 的整株红松植株，参照文献［18-19］

方法，在黑暗条件下将整株苗浸泡在质量分数为

1％的伊文思蓝（Evans blus）染液中染色 50 min

后，将取出的叶片装在含有混合液［φ（乙醇）=

75％，φ（甘油）=5％，φ（蒸馏水）=20％］的 50 mL

离 心 管 中 ，100 ℃ 水 浴 加 热 30 min，氮 蓝 四 唑

（NBT）染色，将叶片放入质量分数为0.1％的NBT

染液中浸泡 8 h，染色结果出现蓝色，表示有 O2

产生。

1. 2. 5 红松 RNA 提取和相关基因表达量的测

定 分别在距离试验结束的72，36，12，6，0 h之前

接种细菌，随后每个处理统一采集12棵红松苗叶

片，用 0.9％的生理盐水冲洗后随机混合，装入

5 mL 离心管内迅速用液氮冷冻，并置于-80 ℃的

冰箱中保存备用。根据植物 RNA 提取试剂盒

（ND5000型，北京百泰克生物技术有限公司）的方

法提取 RNA，提取的 RNA 通过紫外分光光度计

OD260/280检测RNA浓度，质量分数为2％的TAE琼

脂糖电泳检测质量。RNA 使用焦碳酸二乙酯

（DEPC）水稀释至终质量浓度为 1 µg/µL，使用反

转录试剂盒合成单链 cDNA。使用全长转录组序

列通过网站（https：∥sg.idtdna.com/Scitools/Appli‐

cations/RealTimePCR）对 RT-qPCR 引物在线进行

设计（表 1）。基因表达量的测定在含有以下物

质的混合物中进行：12.5 µL 定量染料，上下游引

物各 0.75 µmol/L，100 ng DNA，水 11 µL。使用

RT-qPCR 检测系统（Mx3000P，美国安捷伦公司）

进行 qPCR 测定，反应体系：95 ℃预变性 10 s，然

42

张平，等：解淀粉芽孢杆菌AW3诱导发病红松的抗病机制

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

后 95 ℃变性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，

共40次循环。以Tub基因作为管家基因以使结果

标准化，使用 2-ΔΔCt方法计算每种基因 cDNA 的表

达量［20］

。

1. 2. 6 数据分析 使用 Origin 2020对所有统计

数据进行单因素（ANOVA）和邓肯（Duncan）分析，

对处理组和对照组进行多重比较，P < 0.05 表示

各组间差异显著性。

2　结果与分析

2. 1　芽孢杆菌株 AW3 诱导后对红松根腐病室

内防效

在接种尖孢镰刀菌第10 天后，红松植株发病

症状与苗圃中的红松发病症状一致，对照组叶片

表现出黄化、枯萎，植株相继开始死亡（图 1-A），

到第 30 天，病情指数达到 50.5%，与第 10 天相比

增加41.5%（图1-C）。而处理组，仅部分叶片表现

出黄化、枯萎，植株发病症状得到延缓，并相继长

出新叶（图 1-B），第 30 天，病情指数与对照组相

比下降40%，相对防治效果整体呈现上升趋势，第

30 天防治效果达到 79.3%，与第 10 天相比增加

85.2%（图1-D）。

2. 2　菌株 AW3 诱导后红松 SOD、CAT 和 PAL

酶的活性

图 2 为解淀粉芽孢杆菌 AW3 对红松不同防

御酶活性的影响。由图 2 可见，在接种菌株 AW3

发酵液后，红松在0，6，12，36，72 h 的CAT酶活性

处理组整体呈下降趋势，72 h 达到最小值，是 0 h

时的 66%，而对照组之间差异不显著；PAL 酶活

性处理组在 0，6，12 h 整体呈现上升趋势，12 h 达

到最大值，是0 h时的1.19倍，而36 h后开始下降，

对照组之间有小幅波动，差异不显著；SOD酶活性

处理组在0，6，12 h呈上升趋势，12 h达到最大值，

是 0 h时的 3.95倍，而 36 h后开始下降，对照组之

间差异不显著。

表1 实时定量PCR的引物

Table 1 Primers used for quantitative real-time qPCR

目的基因

PR1-L

NPR-L

AUX

MP-L

JAZ-L

COI

Tub（P）-L

引物序列(5'–3')

AAGACCTTCGGGTCGATG

AGCAGTCATATGTTCCATCG

TTTCCAGCTACGAAGGGAAG

ATCCAATCTGAGTTCCAGGG

ATTGGTTATCTCAAAAGGACTGTTC

AAGATGCGAAAGACCTTGTTCTTG

AAGATCAAAGAGAAAGACTTCTTG

ACCTGACCATGCACGACGACCCACTT

GCGTTCTGGAACAAACAATAG

CAGCTTCTTTTGGGTTGCAGG

TCTCATTCTACCACAAAGGTC

ACCTTCCCAACGTGCCATAAT

CCTGCTTCTCCTGTCACATAG

CTCCTTGTCTCCTTTCCTGC

预测产物大小/bp

18

19

24

21

22

20

18

43

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

2. 3　菌株 AW3 诱导后红松可溶性蛋白和可溶

性糖

图 3 为菌株 AW3 对红松叶片中可溶性蛋白

和可溶性糖含量的影响。由图 3 可见，可溶性蛋

白处理组在 0，6，12 h 整体呈上升趋势，12 h 达到

最大值，是0 h时的1.48倍，而36 h后开始下降，而

对照组仅在72 h出现波动，整体趋势稳定；可溶性

糖处理组在0，6，12，36 h整体呈现上升趋势，36 h

时达到最大值，是 0 h时的 1.64倍，而 72 h后开始

出现下降，而对照组仅出现小幅波动，整体趋势

稳定。

小写字母表示组间差异显著性(P <0.05）

图1　红松根腐病症状和病情指数

Fig. 1 P. koraiensis root rot symptoms and disease index

图2　解淀粉芽孢杆菌AW3对红松不同防御酶活性的影响

Fig. 2 Effects of B. amyloliquefacien AW3 on various defense enzyme activities in P. koraiensis

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张平，等：解淀粉芽孢杆菌AW3诱导发病红松的抗病机制

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 4　菌株 AW3 诱导后红松植株细胞膜透性和

活性氧染色结果

图 4 为细胞膜透性和活性氧染色结果。由

图4可见，在试验结束的第30天，分别对红松整株

苗进行细胞膜透性和活性氧染色，伊文思蓝染色

结果显示，处理组和对照组均出现不同程度着色，

与处理组相比，相对染色强度高出对照组2.57倍，

NBT染色处理组的相对染色强度是对照组的2.98倍，

二者结论一致。

2. 5　红松RNA提取和相关基因表达量

为了验证菌株 AW3 提高红松抗病反应效果

的分子机制，利用RT-qPCR测定与植物抗病和植

物生长激素信号转导相关基因的表达情况，结果

见图 5。由图 5-A 可见，AW3 能明显诱导水杨酸

途径中基因的转录，NRR1基因的处理组在0~6 h

出现上调，6，12，36，72 h开始下调，72 h达到最低

转录值，是 0 h时的 1.31倍，而对照组整体趋势稳

定。由图5-B可见，PR1基因在处理组的0，6，12 h

出现上调，随后开始下调，其中12 h达到最高转录

图3　菌株AW3对红松叶片中可溶性蛋白和可溶性糖含量的影响

Fig. 3 Effects of B. amyloliquefacien AW3 on content of sduble protein and soluble sugar in leaves of P. koraiensis

图4　细胞膜透性和活性氧染色结果

Fig. 4 Results of cell membrane permeability and reactive oxygen species staining

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